[發(fā)明專利]從藍(lán)藻中快速分離純化C－藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810014404.0
• 申請(qǐng)日: 2008-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN101240010A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張玉忠;顏世敢;陳秀蘭;張熙穎;周百成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 許德山

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，屬于藻藍(lán)蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

為了研究蛋白質(zhì)等生物大分子的細(xì)胞定位、相互作用及其動(dòng)態(tài)變化，研究人員急需新技術(shù)和新材料來實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的“標(biāo)識(shí)”、“閱讀”和“查詢”。現(xiàn)在常用的熒光標(biāo)記，由于熒光染料分子熒光特性的限制(熒光光譜較寬、量子產(chǎn)率低)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適用于高通量的生物大分子專一標(biāo)識(shí)。

藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強(qiáng)烈的熒光。在藍(lán)藻和紅藻中，由2-3種藻膽蛋白組成超分子結(jié)構(gòu)藻膽體，形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻類光合作用的學(xué)者提出將藻膽蛋白作為熒光標(biāo)記物，用于診斷試劑。由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，藻膽蛋白和藻膽蛋白標(biāo)記的診斷試劑在90年代初進(jìn)入國際市場。

同常用的熒光標(biāo)記物相比，藻膽蛋白具有下列優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)過程安全、無毒，光能吸收強(qiáng)，熒光產(chǎn)率高，超過90％，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以作雙色、三色和四色標(biāo)記。所以，這類試劑的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。但是，由于價(jià)格昂貴，尚未應(yīng)用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進(jìn)口，也僅限于用細(xì)胞流式儀進(jìn)行的診斷。

藻膽蛋白及其診斷試劑主要由美國生產(chǎn)，德國也有產(chǎn)品向我國推銷，英國和我國臺(tái)灣正在研制。最早研制產(chǎn)品的是美國分子探針公司(Molecular?Probes，Inc.)現(xiàn)在Sigma公司共有6種藻膽蛋白產(chǎn)品，藻膽蛋白-Biotin/Avidin標(biāo)記物12種，RPE-IgG或RPE-IgM12種，RPE單抗標(biāo)記物3種。藻膽蛋白生產(chǎn)沿用已公開的實(shí)驗(yàn)室方法。藻膽蛋白蛋白的種類包括異藻藍(lán)蛋白(APC)、藻藍(lán)蛋白(PC)、藻紅藍(lán)蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類，其中，藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白根據(jù)其光譜特性不同又分為C-藻藍(lán)蛋白(CPC)、R-藻藍(lán)蛋白(RPC)、C-藻紅蛋白(CPE)、b-藻紅蛋白(b-PE)、B-藻紅蛋白(BPE)和R-藻紅蛋白(RPE)。其中存在于藍(lán)藻中的C-藻藍(lán)蛋白(CPC)和異藻藍(lán)蛋白(APC)是目前最常用的藻膽蛋白熒光探針。我國螺旋藻等藍(lán)藻已經(jīng)開始了工業(yè)化培養(yǎng)，資源非常豐富，是分離純化CPC和APC的很好的材料。國際市場上決定購、銷關(guān)系的主要是價(jià)格因素。影響普及型診斷試劑的開發(fā)和應(yīng)用的主要因素也是藻膽蛋白價(jià)格太高。因此，開發(fā)CPC和APC的快速高效分離純化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高純度CPC和APCE的低成本大量制備，對(duì)于CPC和APC在普及型診斷試劑的應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下：

(1)C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的提取

原料為藍(lán)藻，采用液氮研磨的方法，使藍(lán)藻解體溶解，離心去除細(xì)胞殘?jiān)占锨?!-- SIPO -->液得到C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液。

(2)C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的初步純化：

將步驟(1)的粗提液，用硫酸銨沉淀法，使C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白從粗提液中沉淀出來，離心收集沉淀，再用pH5.8～6.0、20mM磷酸緩沖液溶解并透析，除去硫酸銨，即得C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液。

(3)一步法制備高純度C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白

將步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液，用離子交換層析，并用具有恒定的離子強(qiáng)度、連續(xù)pH梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，分別獲得高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白。

優(yōu)選的，上述步驟(1)中的原料藍(lán)藻為單細(xì)胞藍(lán)藻，具體選自螺旋藻或集胞藻。可以自行培養(yǎng)或購買。

所述步驟(1)具體操作如下：

取新鮮的藍(lán)藻，按重量體積比1∶1(g/ml或kg/l)加入液氮進(jìn)行研磨磨碎，然后按鮮藻重量體積比1∶1(g/ml或kg/l)加入0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.8～6.0)，溶解，4℃下，8000rpm～10000rpm離心10min～15min，上清液即為C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的粗提液。

所述步驟(2)具體操作如下：