[發(fā)明專利]一種含未復性重組蛋白的生物制劑及其制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810014363.5
• 申請日: 2008-03-10
• 公開（公告）號: CN101244261A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 厲保秋
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61K47/42;A61K9/08;A61K38/21;A61K38/20;A61K38/27;C07K1/18
• 代理公司: 濟南圣達專利商標事務所
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含未復性重組蛋白的生物制劑及其制備方法與應用。

背景技術(shù)

目前，重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，但人們在分離純化基因工程表達產(chǎn)物時卻遇到了意想不到的困難：很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產(chǎn)物如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白介素-6、人γ-干擾素、G-CSF、IL-2、GM-CSF、漸-18等，不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的直徑約0.1～3.0μm的固體顆粒包涵體，這些基因表達產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，而其立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性；因此，為獲得天然狀態(tài)的目標產(chǎn)物，必須在分離回收包涵體后，溶解包涵體并設法使其中的目標蛋白質(zhì)恢復應有的天然構(gòu)象和活性，這就向生物化學家關(guān)于蛋白質(zhì)折疊機制及復性研究提出了新課題。

包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒；是因在重組蛋白表達過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因造成的。包涵體一般含有50％以上的重組蛋白，其余為核糖體、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5～1μm，具有很高的密度(約1.3mg/ml)，無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

現(xiàn)有技術(shù)中一般是先將重組蛋白純化復性后應用于人體靜脈或腹腔注射，但重組蛋白的復性過程步驟繁瑣、耗時長、成本高，而且產(chǎn)品收率低；另外，在體外進行復性后的重組蛋白進入人體后存在以下不足：1.很容易被酶解；2.半衰期短；3.會形成藥理作用的峰效應，影響了應有的療效。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種含未復性重組蛋白的生物制劑，省略了煩瑣的復性過程，且進入人體后不容易被酶解，不會形成藥理作用的峰效應，不影響重組蛋白應有的療效。本發(fā)明還提供了此生物制劑的制備方法與應用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種含未復性重組蛋白的生物制劑，是由未復性重組蛋白和醫(yī)學上可接受的輔液組成的，其中，未復性重組蛋白與醫(yī)學上可接受的輔液的質(zhì)量比為1∶1～25。

所述醫(yī)學上可接受的輔液是人血清白蛋白，未復性重組蛋白與人血清白蛋白的質(zhì)量比為1∶1～10。

所述醫(yī)學上可接受的輔液是人血清白蛋白和磷脂酰膽堿，其中，人血清白蛋白和磷脂酰膽堿的質(zhì)量比為2～20∶1～5。

所述醫(yī)學上可接受的輔液是人血清白蛋白、海藻糖，其中，人血清白蛋白和海藻糖的質(zhì)量比為1～15∶1～10。

所述醫(yī)學上可接受的輔液是人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇，其中，人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇三者的質(zhì)量比為1～15∶1～5∶1～5。

一種含未復性重組蛋白的生物制劑的制備方法，步驟如下：

(1).制備包涵體；

(2).將包涵體蛋白在變性條件下分離純化，得到高純度的、未復性的、不溶于水的重組蛋白；

(3).與其它醫(yī)學上可接受的輔液混勻，制成可直接靜脈注射或腹腔注射的生物制劑。

所述步驟(2)中的變性條件是：先用6～8mol/L的尿素溶解包涵體，然后采用金屬離子親和層析進行純化。

所述步驟(2)中的變性條件是：先用5～7mol/的鹽酸胍溶解包涵體，然后采用Q-Sepharose?H.P.離子交換層析進行純化。

所述步驟(2)中的變性條件是：先用0.1％～0.3％Triton?X-100及1～3％SDS溶解包涵體，然后采用Q-Sepharose?F.F.離子交換層析進行純化。

一種含未復性重組蛋白的生物制劑作為靜脈注射劑或腹腔注射劑的使用。

本發(fā)明與常規(guī)技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：1、只對重組蛋白進行純化，不進行體外復性，省略了繁瑣的復性過程，成本低、產(chǎn)品收率高；2、將純化處理后的未復性的重組蛋白直接制成生物制劑供靜脈注射用，重組蛋白在體內(nèi)會逐漸復性、逐步發(fā)揮藥理作用，不會被酶解，降低了給藥后的峰值作用，延長藥效作用的半衰期。本發(fā)明的制備方法具有簡單、成本低、收率高等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為實施例1的制備工藝流程圖；

圖2為實施例2的制備工藝流程圖；

圖3為實施例3的制備工藝流程圖；

圖4為實施例4的制備工藝流程圖。

具體實施方式

實施例1：制備含未復性rhIL-2(白介素-2)的生物制劑，步驟如下：