[發(fā)明專利]一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810014059.0
• 申請日: 2008-01-23
• 公開（公告）號: CN101423832A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設計）人: 王金寶;溫建新;朱新產(chǎn);李俊;任慧英;吳家強;張秀美;周順
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司
• 代理人: 姜 明

1、技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域或獸醫(yī)生物制品領域，具體是一種對豬體 核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序。

2、背景技術

近年來由于分子生物學的發(fā)展，使得疫苗學進入了一個嶄新的分子免疫時 代，其標志是各種分子免疫增強劑的研究和應用。如何進一步提高傳統(tǒng)疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增強劑的應用，能全面提高機體的整體免疫 水平，增強抗病防御和免疫應答能力，提高疫苗保護率。其中，CpG基序(CpG寡聚 脫氧核苷酸)的研究是其中的焦點。CpG序列已被證實能作為疫苗的高效免疫增 強劑，使用得當能夠大幅度提高疫苗的免疫保護率和機體的免疫水平。近來大量 免疫學研究證實：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)誘導B細胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗誘生的細胞凋亡；(3)誘導單核細胞 分泌IL-12及其他細胞因子；(4)活化自然殺傷(NK)細胞的裂解活性和干擾素 (IFN-γ)分泌。

使用CpG寡核苷酸作佐劑要面臨的一個較復雜的問題就是對于不同的物種 其最佳的CpG序列不同，比如對鼠免疫刺激效果最好的序列是5’-GACGTT-3’ (Zina?et?al，1998)，對人的刺激作用最強的是5’-GTCGTT-3’。目前開發(fā) CpG佐劑要解決的問題是確定不同的DNA疫苗所需要的含CpG寡核苷酸的最合適 的劑量以及對不同物種具有特異性的寡核苷酸序列。

我國是世界養(yǎng)豬大國，2002年以來生豬飼養(yǎng)量在11億頭以上，在畜牧業(yè)生 產(chǎn)中占有較大的比重，同時養(yǎng)豬業(yè)也是我國部分省區(qū)的主要生產(chǎn)支柱和新的經(jīng) 濟增長點。但面對當前養(yǎng)豬業(yè)重大疫病發(fā)生和流行愈加復雜的形勢——舊病未 除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學理論和生產(chǎn)技術來 發(fā)展豬用安全、高效疫苗預防和控制各種疫病的發(fā)生和流行，而免疫增強劑的 研制是疫苗研究的主要組成部分。

3、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，可使DNA 疫苗產(chǎn)生更有效的免疫反應。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的：人工合成一種CpG基序，其引物序 列如下：

7-A：CTCATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATGGGCC

7-B：CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC

注：a、加黑部分需硫代修飾

CpG基序的免疫增強作用檢驗步驟如下：

1)選擇15頭健康豬(長白×大白二元雜交)，120日齡左右，體重90—115kg， 經(jīng)檢疫，健康狀況良好。

2)外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)

采集肝素抗凝血，用PBS(PH7.4)稀釋液1∶1稀釋，小心疊加于2倍體積孵 育至室溫的淋巴細胞分離液上，以1500rpm水平離心25min。將收集血漿層與淋 巴細胞分離液層之間的淋巴細胞層，放入含PBS(PH7.4)洗滌液5ml的試管中， 充分混勻后，以1000rpm離心10min。棄上清液沉淀用5mlPBS(PH7.4)洗滌液以 1000rpm離心10min洗兩次，所得即是淋巴細胞。細胞沉淀用5ml含10％犢牛血 清的RPMI1640營養(yǎng)液懸浮。進行活力檢測與計數(shù)。

3)脾臟免疫細胞的分離

取豬脾臟，剪碎，然后用研磨器勻漿。勻漿液經(jīng)150目銅網(wǎng)過濾，濾液經(jīng) 2000rpm離心10min收集細胞泥。用2ml紅細胞裂解液懸浮，室溫處理5min， 然后用10ml?GKN溶液中和混勻后2000rpm離心10min。將細胞沉淀用PBS離心 洗滌3-4次，至細胞沉淀純白色。細胞沉淀用5ml含10％犢牛血清的RPMI1640 營養(yǎng)液懸浮，進行活力檢測與計數(shù)。

4)活力檢測與計數(shù)