[發(fā)明專利]擬康氏木霉胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810014047.8
• 申請日: 2008-01-23
• 公開（公告）號: CN101220101A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鵬英;陳靠山;郝林華;魏廣金
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12P19/04;A61K31/715;A61P35/00;C12R1/885
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 許德山

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種具有增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤生長的多糖，特別涉及擬康氏木霉CGMCC?No.1443(Trichoderma?pseudokoningii)所產(chǎn)生的具有免疫活性的胞外多糖(簡稱木霉多糖，EPS)及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

木霉按傳統(tǒng)分類系統(tǒng)，隸屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、絲孢科(Hyphomycetaceae)。木霉是一類分布廣泛的真菌，除個別種為弱致病菌外，多數(shù)對植物病原菌具有拮抗作用，是生防真菌中研究和應(yīng)用最多一種，它對多種病原菌都有抑制作用，是一類理想的防治土傳病害的生防菌。

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，可以控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長衰老的一類活性多糖。真菌的多糖化合物具有很強(qiáng)的生物活性，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗衰老、降血脂、抗?jié)儭⒖寡趸确矫妗?qiáng)免疫和抗腫瘤活性是多糖重要的生物活性。研究表明，多糖可以通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性、激活細(xì)胞因子的分泌、誘導(dǎo)生成抗體及激活補體系統(tǒng)等作用增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。多糖的抗腫瘤途徑主要為抑制腫瘤細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)及核酸的合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響癌基因的表達(dá)及改變腫瘤細(xì)胞膜的生長特性。擬康氏木霉CGMCC?No.1443是一種具有很強(qiáng)生長勢的木霉，木霉的生長發(fā)育和孢子的產(chǎn)生需要的環(huán)境條件(營養(yǎng)、溫度、pH值、光照等)都比較簡單，營養(yǎng)生長非常迅速。擬康氏木霉CGMCC?No.1443分泌大量活性胞外多糖，其胞外多糖分泌條件簡單，含量高，每升培養(yǎng)液中，粗多糖的含量可達(dá)700mg，其分離純化方式簡單，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價值。CN1748511(200510044527.5)公開了含有擬康氏木霉CGMCC?No.1443的生物制劑，用于防治植物多種病害。目前還沒有關(guān)于擬康氏木霉CGMCCNo.1443胞外多糖具有免疫活性的報道和專利公開，我們從擬康氏木霉發(fā)酵液中分離純化的多糖，具有較強(qiáng)的免疫激活能力，能夠顯著誘導(dǎo)纖維瘤細(xì)胞的凋亡，延長S180腹水瘤小鼠壽命，減輕S180實體瘤小鼠的瘤重，增加其脾指數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一旨在提供一種擬康氏木霉胞外多糖。

本發(fā)明的目的之二旨在提供一種擬康氏木霉胞外多糖的制備方法。

本發(fā)明的目的之三旨在提供擬康氏木霉胞外多糖的重要用途。

本發(fā)明的擬康氏木霉胞外多糖，其特征在于，

(1)通過高效凝膠過濾層析檢測，其具有單一對稱峰，分子量為18325；

(2)通過改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法檢測，其中性多糖含量為65.2％，糖醛酸含量為32.6％；

(3)通過糖醇乙酸酯的氣相色譜(GC)分析，其單糖組成為鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)，摩爾比為Rha∶Glc∶Gal＝5.6∶2.7∶1.0。

該多糖完全還原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為Rha∶Glc∶Gal＝14.5∶9.3∶1.0，并且其含有摩爾含量為26.6％的葡萄糖醛酸。這種擬康氏木霉胞外多糖，是將擬康氏木霉發(fā)酵液脫色、濃縮、醇沉和去蛋白后，通過凝膠層析柱純化得到的均一多糖。

本發(fā)明的擬康氏木霉胞外多糖的制備方法，包括步驟(1)粗多糖的制備和步驟(2)多糖的純化，其特征在于，所述步驟(1)粗多糖的制備，包括：

A、將擬康氏木霉接入液體培養(yǎng)基后，28℃、130轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)振蕩培養(yǎng)6天(d)；

B、過濾離心除去菌絲和孢子，過3520樹脂柱脫色，收集洗脫液，減壓濃縮至原體積的1/4；

C、濃縮液用Sevag法脫蛋白；

D、加入乙醇于4℃靜置過夜，離心收集沉淀，用乙醚、丙酮、95％乙醇依次洗滌，沉淀溶于蒸餾水，透析48小時(h)后濃縮到原體積1/4，經(jīng)冷凍干燥得胞外粗多糖樣品，

所述步驟(2)多糖的純化，包括：

A、采用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-75柱層析法，準(zhǔn)確稱取木霉胞外粗多糖1g，溶于10ml的水中，上柱，室溫下用水進(jìn)行洗脫，控制流速0.4ml/min；

B、用分部自動接收器每15分鐘一管(min/管)，苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測，于490nm處測定光吸收值；

C、根據(jù)洗脫體積對吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖初步純化組分；