[發(fā)明專利]一種檢測土壤酸性磷酸單酯酶活性的分析方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810012246.5
• 申請日: 2008-07-09
• 公開（公告）號: CN101625311A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玉蘭;武志杰;陳利軍;陳振華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;C12Q1/44
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 馬 馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤中磷酸單酯酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中磷酸單酯酶活性的分析方法。

背景技術(shù)

土壤中的磷酸單酯酶能將在土壤磷代謝過程中形成的有機磷酯水解成正磷酸鹽，參與有機磷的脫磷過程，成為可被微生物和作物利用的有效態(tài)。在pH4-9的土壤中均有磷酸單酯酶，多以積累態(tài)存在。

磷酸單酯酶可水解對硝基苯磷酸鹽，通過比色法測定反應(yīng)后釋放的對硝基苯酚的含量，來估算磷酸單酯酶的活性。酸性和堿性磷酸酶的活性可以通過控制反應(yīng)的pH值來分別測定。

因此，土壤中磷酸單酯酶活性的強弱影響到土壤磷代謝過程中磷素損失的大小，間接影響磷肥的利用效率。土壤磷酸單酯酶對土壤磷素的有效性具有重要作用，可以表征土壤磷酸轉(zhuǎn)化方向和強度。土壤中磷酸單酯酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質(zhì)地等的強烈影響，同時也受農(nóng)田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中磷酸單酯酶活性的檢驗具有重要的意義。目前有關(guān)磷酸單酯酶活性的測定雖然已經(jīng)形成一個相對可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤類型測定的差異性，以及不同培養(yǎng)批次的差異性和不確定性，難以定性比較和定量研究土壤中磷酸單酯酶活性，降低了實驗效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種土壤中磷酸單酯酶活性的檢測方法。在借鑒其它酶測定方法原理的基礎(chǔ)上，該方法根據(jù)磷酸單酯酶的特性，對其測定步驟和顯色方法進行改進。該方法減少了試驗步驟的不穩(wěn)定性，使分析結(jié)果更加精確可靠，分析重現(xiàn)性更好。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種檢測土壤中酸性磷酸單酯酶活性的分析方法，

1)分別稱取1-2g鮮土樣品2n份分別置入2n個50mL三角瓶中，n≥3，分成二組，每組n個，向二組2n個三角瓶中加入0.2-0.4ml分析純甲苯和4-8ml?pH?6.45-6.55緩沖溶液試劑，向第一組n個三角瓶中加入1-2mL?25-50m?moL·L^-1的底物對硝基苯磷酸二鈉工作液，以第二組n個三角瓶中作為樣本對照，混勻，蓋好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1-2h；

2)培養(yǎng)結(jié)束后，向所有三角瓶中加入4-8mL?0.09-0.11moL·L^-1?pH11.5-12.5的堿性三羥基氨基甲烷溶液和1-2mL?0.25-0.5moL·L^-1氯化鈣溶液，向樣本對照組n個三角瓶中添加1-2mL?25-50m?moL·L^-1的底物對硝基苯磷酸二鈉工作液，混勻，過濾；

試驗中加入的堿性緩沖液溶液是用來終止酶促反應(yīng)，抑制磷酸單酯到磷酸的反應(yīng)，且不會產(chǎn)生強堿對土壤有機質(zhì)的分解作用而對產(chǎn)物測定產(chǎn)生顏色干擾，同時避免在一定時間內(nèi)產(chǎn)生沉淀而影響測定。

3)用分光光度法于410nm處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；

以對硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別用分光光度法在410nm測定的吸光值A(chǔ)’制作工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b；

根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度S，S＝A*b；計算樣品中對硝基苯酚含量m₁；

4)計算磷酸單酯酶酶活性：

計算公式為：w＝m₁/(m₂×K)＝Sμg?C₆H₅NO₃·g^-1干土·h^-1

式中：w：單位土壤單位時間內(nèi)對硝基苯酚的產(chǎn)生量；m₁：測試溶液中對硝基苯酚的質(zhì)量，樣品測定吸光值折換的產(chǎn)物質(zhì)量值；m₂：鮮土樣品質(zhì)量；k：水分系數(shù)，單位重量的烘干土重/鮮土重。

當(dāng)步驟3)中的待測液顏色明顯超過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度時溶液的顏色，表明其中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖溶液稀釋5-10倍后再進行比色，若顏色還是過深(目測比對制作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度時的溶液顏色)，則重復(fù)上述稀釋過程；最終再用分光光度法于410nm處測定溶液的吸光度A。