[發(fā)明專利]用于制備檢測DNA甲基化試樣的試樣處理液和試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810008337.1
• 申請日: 2008-02-26
• 公開（公告）號: CN101255476A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梶田昌裕;酒井綾子;山本憲明;石原英干
• 申請（專利權(quán)）人: 希森美康株式會(huì)社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京金之橋知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 梁朝玉;劉良勇

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種用于制備檢測DNA甲基化試樣的試樣處理液和試劑盒。也就是說，本發(fā)明涉及一種使用該試樣處理液和試劑盒的試樣制備方法和DNA甲基化檢測方法。

背景技術(shù)：

在高等真核生物的染色體DNA中，有時(shí)在構(gòu)成DNA的堿基中，C(胞核嘧啶)5端受到甲基化修飾。高等真核生物中的DNA甲基化與原核生物不同，作為遺傳信息的表達(dá)抑制機(jī)構(gòu)發(fā)揮著功能。比如當(dāng)含有大量某種基因的CpG區(qū)域(CpG島、CG島)甲基化時(shí)，其基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。相反，當(dāng)CpG島沒有甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄基因可結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，基因處于可轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。如此，DNA甲基化是基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)構(gòu)之一，對早期胚胎發(fā)育、組織變異的基因表達(dá)、哺乳動(dòng)物特有現(xiàn)象的基因印記和X染色體失活、染色體穩(wěn)定化、DNA復(fù)制的時(shí)機(jī)等種種生理和病理現(xiàn)象起著重要作用。近年來，人們越來越明白，這種DNA的甲基化強(qiáng)烈地干預(yù)癌癥和其他疾病。

作為DNA甲基化的分析方法，一般都使用甲基化特異PCR(Methylation?specific?Polymerase?Chain?Reaction、以下稱“MS-PCR”)。(James?G.HERMAN?et?al.，Methylation-speCifiCPCR：A?novel?PCR?assay?for?methylation?status?of?CpG?islands，ProC.Natl.ACad.SCi.USA，Vol.93，pp.9821-9826，September?1996)。過去使用的這種方法(以下稱“標(biāo)準(zhǔn)法”)分四個(gè)步驟進(jìn)行：

1)從生物樣本中提取基因組DNA(約3小時(shí))

2)用重亞硫酸鹽修飾提取的基因組DNA(約16小時(shí))

3)純化修飾的基因組DNA(約1小時(shí))，及

4)PCR反應(yīng)(約2小時(shí))

如此，標(biāo)準(zhǔn)法非常費(fèi)時(shí)(合計(jì)約22小時(shí))。問題是尤其PCR反應(yīng)之前的生物樣本的前處理(制備DNA甲基化檢測用試樣)很復(fù)雜，僅前處理(上述1～3)就需要約20小時(shí)。

為了縮短長時(shí)間的前處理時(shí)間，有人提議用高濃度重亞硫酸鹽進(jìn)行上述2)的重亞硫酸鹽修飾(Masahiko?SHIRAISHI?and?HikoyaHAYATSU，High-Speed?Conversion?of?Cytosine?to?UraCil?inBisulfite?GenomiC?SequenCing?Analysis?of?DNA?Methylation，DNARESEARCH?11，409-415(2004))。用此方法(以下稱“快速法”)的話，用標(biāo)準(zhǔn)法約需16小時(shí)，用重亞硫酸鹽修飾只需20分鐘即可。因此，前處理時(shí)間從約20小時(shí)縮短為約4小時(shí)。然而，用此快速法前處理也要約4小時(shí)。

日本專利公開第2005-058217號公報(bào)公開了一種甲基化DNA檢測方法，是用含有異硫氰酸胍、碘化鈉、尿素和SDS等蛋白質(zhì)變性劑的溶液溶解微量的細(xì)胞標(biāo)本，用上述標(biāo)準(zhǔn)法的重亞硫酸鹽處理液處理。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)專利公開第2005-058217號公報(bào)上公開的方法有以下幾個(gè)問題：

1)當(dāng)生物樣本蛋白質(zhì)含量多時(shí)，DNA甲基化的檢測結(jié)果不穩(wěn)定；

2)使用高濃度重亞硫酸鹽的快速法，因進(jìn)行重亞硫酸鹽處理的試樣的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生鹽析，故檢測結(jié)果也不穩(wěn)定。

因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于制備DNA甲基化檢測用試樣的試樣處理液和試劑盒、使用該試樣處理液和該試劑盒的試樣制備方法和DNA甲基化檢測方法，這種方法可以在DNA甲基化檢測中得出穩(wěn)定的檢測結(jié)果，并且前處理簡便易行。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用含有蛋白酶和水性溶劑的試樣處理液處理生物樣本，可以獲得穩(wěn)定的DNA甲基化檢測結(jié)果，從而完成了本項(xiàng)發(fā)明。

即，本發(fā)明提供：

一種用來制備DNA檢測用試樣的試樣處理液，其特征在于：所述試樣處理液含有蛋白酶和水性溶劑。

所述的試樣處理液還含有表面活性劑和/或離液劑。

所述的試樣處理液的表面活性劑是選自十二烷基硫酸鈉、十四烷硫酸鈉、十二(烷)磺酸鈉、十四烷磺酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c和?；敲撗跄懰徕c中的至少一種。

所述的試樣處理液的離液劑是選自硫氰酸胍、硫氰酸鈉、鹽酸胍、碘化鈉、碘化鉀和尿素中的至少一種。

所述的試樣處理液中還含有可以切斷DNA的切斷劑。

所述的試樣處理液，其pH值為7～10。