[發明專利]一種抗HCV的疫苗及其制備方法和用途

無效

• 申請號: 200780052831.1
• 申請日: 2007-12-18
• 公開（公告）號: CN101663399A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發明（設計）人: 魏來;田園
• 申請（專利權）人: 北京大學人民醫院
• 主分類號: C12N15/51
• 分類號: C12N15/51;C12N15/85;C12N15/86;C12N15/861;C07K14/18;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/14
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 謝順星

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地涉及一種抗丙型肝炎病毒的疫 苗，以及該疫苗的制備方法和用途。

背景技術

丙型肝炎病毒(hepatitis?C?virus，HCV)感染是一個重要的公共衛 生問題，全世界HCV感染達1.7億人，我國HCV感染的標化流行率 約為3.2％。HCV感染的顯著特征為慢性化率高，而HCV慢性感染 是導致肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病的主要原因。

清除病毒能改善肝臟炎癥，抑制肝纖維化及防止病情進展。干擾 素(interferon，IFN)α聯合利巴韋林(ribavirin，RBV)是治療HCV感染唯 一相對有效的藥物，但持久應答率(sustained?virological?response，SVR) 低，且仍有部分患者無應答或治療后復發。雖然聚乙二醇化的干擾素 的問世可使SVR提高到50-60％，但仍有相當部分患者經系統治療后 不能獲得SVR，因此，人們迫切需要尋找HCV治療的新藥物和新方 法。

慢性HCV患者體內缺乏抗原特異性的細胞和體液免疫，這可能 是HCV病毒持續感染的主要原因。病毒感染免疫的啟動是由T細胞 和抗原遞呈細胞(antigen?presenting?cell，APC)相互作用而介導，而 特異性免疫應答需要抗原遞呈細胞有效地攝取、處理和遞呈抗原給T 淋巴細胞，同時通過信號分子的刺激活化T細胞，以激活特異性免疫 反應，抑制或清除病毒感染。因此，研究HCV治療性疫苗，激活慢 性HCV感染者體內特異性免疫反應，從而清除病毒可能會成為慢性 丙型肝炎分子治療的有效手段。

目前研究較多的HCV肽疫苗誘導的免疫反應較弱，且受HLA 型別的限制，適用人群范圍較窄，而HCV結構基因的表達被證實損 害DC的功能，因此，HCV非結構基因理應成為制備HCV疫苗的主 要候選基因。

發明內容

本發明人通過構建HCV各種非結構基因串聯組合后再與腺病毒 重組的復制缺陷型腺病毒載體，得到了理想的用于治療丙型肝炎的疫 苗，從而為慢性HCV感染的免疫治療奠定了基礎。

發明人經研究發現，兩個基因串聯比單一基因以及多個HCV表 位肽聯合免疫誘導的細胞免疫反應強，同時克服了使用更多的非結構 基因串聯免疫的缺陷，包括容易出現擴增、轉錄以及翻譯的錯誤，和 由于腺病毒載體的容量有限而造成的重組困難等。

因此，本發明的一個目的是提供一種用于治療丙型肝炎的重組腺 病毒載體疫苗；所述的載體疫苗分別攜帶HCV非結構基因NS3/NS4 和NS4/NS5。

本發明的另一個目的是提供攜帶HCV非結構基因的載體疫苗的 制備方法；

本發明的再一個目的是提供重組腺病毒載體疫苗在制備治療丙 型肝炎的藥物中的應用。

為了實現本發明目的，本發明重組腺病毒載體疫苗的構建如下：

1、由感染HCV(1b型)的病人血清提取RNA，RT-PCR擴增HCV NS3，NS4，NS5，NS3/NS4和NS4/NS5基因。擴增基因的引物見下表1：

表1：PCR引物

2、將HCV?NS基因克隆至Pshuttle-CMV質粒。目的基因和載 體的雙酶切：HCV?NS基因PCR產物酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收， XbaI，XhoI雙酶切HCV?NS3，NS4，NS3/NS4擴增產物和 Pshuttle-CMV質粒，EcoRV，XhoI雙酶切HCVNS5，NS4/NS5擴增 產物和Pshuttle-CMV質粒。

酶切反應體系

加入ddH₂O至總體積為????50μl

在T4DNA連接酶作用下將目的基因和載體按摩爾比3∶1進行連 接。

3、將攜帶目的基因的Pshuttle-CMV質粒與腺病毒骨架質粒 Adeasy1(來源于5型腺病毒，即Ad5)在大腸桿菌BJ5183中重組，使 用PacI內切酶鑒定重組正確的大質粒，并進行大量制備。

4、腺病毒的包裝、擴增和純化。PacI酶切釋放腺病毒基因組， 脂質體轉染293細胞，7-10天后收集細胞，反復凍融，CsCl密度梯 度離心取上清，即含純化的感染性腺病毒顆粒，腺病毒滴度達到 10¹¹PFU/ML。