[發(fā)明專利]用于純化至少一種待鑒定的靶物質(zhì)的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200780041386.9
• 申請日: 2007-11-07
• 公開（公告）號: CN101535808A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 約亨·彼得
• 申請（專利權(quán)）人: 約亨·彼得
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C12N5/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 程金山

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于純化至少一種待鑒定的靶物質(zhì)的方法，所述靶物質(zhì)是在培養(yǎng)細胞時，在細胞培養(yǎng)基中存在或形成的，在所述方法中，將磁性粒子加入到所述細胞培養(yǎng)基中，并通過應(yīng)用磁場從所述細胞培養(yǎng)基中選擇靶物質(zhì)附著的粒子，所述磁性粒子稱為珠，其表面被官能化并且所述靶物質(zhì)選擇性附著在所述表面上。

現(xiàn)有技術(shù)

優(yōu)選地使用一般方法制備分離由細胞釋放到細胞培養(yǎng)基中的物質(zhì)，從而研究細胞特性及其進一步的生長行為。具體相關(guān)應(yīng)用是研究腫瘤細胞，其不受控的細胞生長是人類死亡最常見的原因。

為了提供抵抗在人中檢測到的腫瘤的可靠治療，需要最初確定腫瘤的類型，例如它是非-侵入還是侵入類型的腫瘤，或是原位導管癌，等等。隨后的治療依賴于腫瘤類型，因為腫瘤細胞進展導致腫瘤細胞性質(zhì)的改變。例如，非-侵入性癌細胞系MCF-7包含雌激素受體，因此雌激素受體抑制劑，例如他莫昔芬能夠治療這種類型的腫瘤。在進展過程中，良性的，即非-侵入性腫瘤細胞能夠轉(zhuǎn)化為惡性的，即侵入類型的細胞，其表面上不再有雌激素受體，由此排除了激素治療的可能性。

腫瘤進展主要由突變觸發(fā)，突變又可以是由外部效應(yīng)諸如缺氧(缺氧癥)引起的。除這樣的事實之外，即腫瘤細胞表面特別具有經(jīng)歷由突變引起的類型、作用和數(shù)量的主要改變的受體外，腫瘤細胞還改變它們與不同調(diào)節(jié)肽和蛋白分泌有關(guān)的行為。

現(xiàn)代蛋白質(zhì)組研究中的一種用于從血清/血漿中鑒定腫瘤標記的方法是使用多種層析步驟，即二-維凝膠電泳和隨后的質(zhì)譜法。然而，目前，因為血清/血漿中非常高度濃縮的蛋白質(zhì)遮蔽標記，關(guān)于潛在標記的研究已經(jīng)中斷。由于該原因，越來越多地對腫瘤細胞系進行測試。然而，這些關(guān)于腫瘤細胞的測試顯示，細胞僅以極低的濃度，即10^-12-10^-9M的量釋放肽和蛋白質(zhì)。因為目前質(zhì)譜儀的檢測極限是10^-9M，并且為了用質(zhì)譜儀檢測，物質(zhì)必須以高純度狀態(tài)存在，所以需要有效的純化步驟，從而濃縮細胞培養(yǎng)物上清液中的分析物，例如分泌的分子。

為了該原因，蛋白質(zhì)組研究的注意力目前集中于預(yù)-分析以低濃度存在的物質(zhì)。然而，對少量蛋白質(zhì)進行一系列不同的連續(xù)純化步驟由于這樣的事實而導致蛋白質(zhì)的嚴重-完全損失，所述事實是蛋白質(zhì)與使用的容器壁形成非特異性結(jié)合。當實施很多次純化步驟時遭遇的另一個問題是樣品變得愈加被污染，并且因此使得質(zhì)譜分析由于干擾信號而不能進行。為了該原因，細胞分泌物測試僅能夠?qū)Ψ浅８叩募毎嫈?shù)進行。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)關(guān)于起始細胞計數(shù)在10⁷個細胞數(shù)量級，且增殖狀態(tài)在包含血清的培養(yǎng)基中持續(xù)數(shù)日，并隨后在無血清環(huán)境中培養(yǎng)的實驗僅生成很少mg的總蛋白。例如，在用10⁹個細胞的細胞計數(shù)進行的細胞培養(yǎng)過程完成后，對酵母細胞的測試測量到上清液中AIP蛋白質(zhì)濃度為30nM。然而，通常不可能使用如此大量的細胞進行分析。例如，在癌細胞測試中，所述癌細胞是通過活組織檢查從腫瘤組織中切除的，每針芯樣品最多能夠分離10⁵個細胞，但是其中包含的許多細胞不是腫瘤細胞。由于分布的物質(zhì)非常低的濃度，因此在單一純化步驟中有效地分離分泌物分子和在沒有任何中間步驟的條件下執(zhí)行隨后的分析程序是非常重要的。

在過去的5年中，已經(jīng)嘗試使用SELDI-TOF?MS技術(shù)(表面增強激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜法)作為篩選細胞分泌的肽和蛋白質(zhì)的方法。在該方法中，將待測試的樣品置于具有主要是疏水性表面的3mm²芯片上。隨后，通過激光轟擊將與芯片結(jié)合的蛋白質(zhì)電離，在質(zhì)譜儀中檢測，并隨后顯現(xiàn)在二維圖像上。例如，該方法使不同癌細胞系能夠彼此間比較。然而，限制因素是該技術(shù)不充足的靈敏性。該系統(tǒng)的靈敏性極限通常是最大300nM，且因此，目前，SELDI-TOF?MS技術(shù)仍僅用于確定血清樣品的特征。

只能通過使用較小尺寸的粒子來增高靈敏性，因為這為結(jié)合蛋白提供更大的總表面積。利用磁性粒子作為結(jié)合蛋白質(zhì)和肽的載體使該過程能夠自動進行，并由此獲得更大的樣品通量。利用與磁性鏈霉抗生物素珠附著的生物素化的抗體示范了磁性粒子分離蛋白質(zhì)的用途，所述磁性粒子也稱其為磁珠，并將其成功地用在關(guān)于獲自血清的prostrate特異性抗原(PSA)的質(zhì)譜測試中。然而，當使用磁性“抗體粒子”時，每次僅能分離一種蛋白質(zhì)。