[發明專利]用于純化至少一種待鑒定的靶物質的方法

無效

• 申請號: 200780041386.9
• 申請日: 2007-11-07
• 公開（公告）號: CN101535808A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 約亨·彼得
• 申請（專利權）人: 約亨·彼得
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C12N5/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 程金山

1.用于純化至少一種在培養細胞時在細胞培養基中存在或形成的待鑒定靶物質的方法，在所述方法中，將磁性粒子加入到所述細胞培養基中，所述磁性粒子它們稱為珠，在所述磁性粒子的表面上進行官能化且所述靶物質選擇性附著于所述磁性粒子的表面，并且通過應用磁場，從所述細胞培養基中選擇所述靶物質附著的粒子，所述方法特征在于下列方法步驟：

-提供血清替代物，所述血清替代物獲自天然血清，并且不具有或幾乎不具有質量小于或等于60kDa、特別是小于或等于10kDa的低分子物質，

-將所述血清替代物加入到所述細胞培養基中，所述細胞培養基已包含細胞或向其中加入了細胞，

-在富含血清替代物的細胞培養基中培養所述細胞，

-分離至少一些在所述培養過程中形成的細胞培養物上清液，

-通過超濾方法，過濾所述細胞培養物上清液，以獲得保留物，

-以這樣的方式提供所述珠，所述方式是所述珠的官能化表面包括多個每個包含多至10個分支，即10代的樹狀聚體，每個樹狀聚體最后一代的末端點被修飾，

-將所述珠和緩沖溶液加入到所述保留物中，以形成混合物，

-溫育包含在所述保留物中的靶物質，并使其與所述珠結合，并從所述混合物中磁性選擇出所述磁珠。

2.按照權利要求1的方法，其特征在于，在超濾來自動物或人的天然血清后，獲得作為保留物的血清替代物，并且特征在于，用生長培養基或緩沖液洗滌所述保留物。

3.按照權利要求2的方法，其特征在于，使用Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)、IMDM、IMEM、ERDF或RPMI1640作為所述生長培養基洗滌溶液。

4.按照權利要求1-3中任一項的方法，其特征在于以下列方式獲得和提供所述血清替代物：

a)利用超濾裝置離心天然血清，以獲得上清液和滲透物，所述上清液稱其為保留物，

b)將生長培養基加入到所述保留物中，并隨后按照步驟a)進行離心過程，

c)重復步驟b)n次，

d)將生長培養基加入到獲得的保留物中，以獲得眾所周知的血清上清液，和

e)過濾所述血清上清液，以獲得對應于所述血清替代物的滲透物。

5.按照權利要求4的方法，其特征在于，當過濾所述血清上清液時，進行無菌過濾。

6.按照權利要求4的方法，其特征在于，在步驟a)之前，向所述天然血清中加入至少一種可逆或不可逆的蛋白酶抑制劑。

7.按照權利要求6的方法，其特征在于，將苯基甲基磺酰氟(PMSF)和/或乙二胺四乙酸(EDTA)和/或蛋白原抑制劑單獨作為蛋白酶抑制劑加入到所述血清中，或作為蛋白酶抑制劑混合物加入到所述血清中。

8.按照權利要求4的方法，其特征在于，步驟a)和b)中的離心過程在環境溫度到低至+4℃的溫度下進行至少1小時。

9.按照權利要求4的方法，其特征在于，重復步驟b)n次，n是2-5。

10.按照權利要求4的方法，其特征在于，步驟e)中的過濾過程利用0.2μm無菌過濾器進行。

11.按照權利要求1的方法，其特征在于，在過濾前，將所述細胞培養物上清液冷凍在-20℃—-80℃，特征在于，將冷凍的細胞培養物上清液解凍，并且特征在于，通過利用超濾裝置的離心方式進行過濾。

12.按照權利要求1的方法，其特征在于，當加入所述珠和所述保留物時，使用離液序列低的緩沖溶液。

13.按照權利要求1的方法，其特征在于，在培育后和在包含在所述保留物中的靶物質結合于所述珠并且已經磁性選擇所述珠后，用低鹽緩沖溶液洗滌具有所述靶物質的珠，并且特征在于，隨后在包含至少一種有機成分和/或酸的混合物中，從所述珠洗脫下至少一種靶物質。

14.按照權利要求13的方法，其特征在于，使用醇或乙腈作為所述有機物質，并使用羧酸或單-、二-、三鹵代羧酸作為所述酸。

15.按照權利要求1-14中任一項的方法，其特征在于，使用Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)、IMDM、IMEM、ERDF或RPMI1640作為洗滌溶液。