[發明專利]重組蛋白的重折疊

有效

• 申請號: 200780031808.4
• 申請日: 2007-07-13
• 公開（公告）號: CN101506222A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 謝利·皮扎羅;艾倫·桑切斯;查爾斯·H·施梅爾澤
• 申請（專利權）人: 健泰科生物技術公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 岑曉東

1.一種用于從原核細胞培養物中回收重折疊的重組蛋白的方法，其中所述 重組蛋白是VEGF₁₆₅，該方法包括下列步驟：

(a)從所述原核細胞培養物中分離重組蛋白；

(b)使所述蛋白質在第一緩沖溶液中溶解，所述第一緩沖溶液其pH大于 9且包含(i)終濃度1M尿素、300mM精氨酸、10mM?CHES、5mM EDTA，pH?11；或(i)終濃度1M尿素、300mM精氨酸、10mM?TRIS、 5mM?EDTA，pH?11；

(c)使所述溶解的蛋白質在第二緩沖溶液中重折疊，所述第二緩沖溶液 其pH大于9但小于等于11且包含(i)終濃度1M尿素、15mM半胱氨 酸、2mM?DTT、100mM精氨酸、10mM?CHES、5mM?EDTA，pH?10； 或(ii)終濃度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM?DTT、100mM 精氨酸、10mM?TRIS、5mM?EDTA，pH?10且在室溫以 ak_La＝0.001-0.1min^-1通入空氣或氧氣達6-24小時；并

(d)回收所述重折疊的重組蛋白。

2.權利要求1的方法，其中將所述重組蛋白在所述第一緩沖溶液中溫育至 少1小時。

3.權利要求2的方法，其中所述溫育是在2-40℃進行的。

4.權利要求1的方法，還包括通過通入氮氣來使所述重折疊的重組蛋白穩 定。

5.權利要求1的方法，其中所述回收步驟(d)包括：使含有所述重組蛋白的 所述第二緩沖溶液澄清，并使所述重折疊的重組蛋白相繼接觸混合式層 析支持物、陽離子層析支持物、和第一疏水相互作用層析支持物，并從 每個支持物中選擇性洗脫所述重折疊的重組蛋白。

6.權利要求5的方法，其中所述澄清步驟包括：添加去污劑至1％的終濃度， 調節pH至8.5-9.5，在25-30℃將溶液溫育1-10小時，將所述溶液離心；并 將從所述離心步驟中回收的液體過濾。

7.權利要求5的方法，還包括：使所述重折疊的重組蛋白接觸第二疏水相 互作用層析支持物或離子交換支持物，并從所述支持物中選擇性洗脫所 述重折疊的重組蛋白。

8.權利要求5的方法，其中所述第一疏水相互作用層析支持物選自丁基-、 丙基、辛基-、苯基-和芳基-瓊脂糖樹脂。

9.權利要求7的方法，其中所述第二疏水相互作用層析支持物選自丁基-、 丙基、辛基-、苯基-和芳基-瓊脂糖樹脂。

10.一種用于從原核細胞培養物中回收重折疊的重組蛋白的方法，其中所述 重組蛋白是VEGF₁₆₅，該方法包括下列步驟：

(a)從所述原核細胞培養物中分離重組蛋白；

(b)使所述蛋白質在緩沖溶液中溶解并重折疊，所述緩沖溶液其pH大于 9但小于等于11且包含(i)終濃度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM?CHES、5mM?EDTA，pH10；或(ii)終 濃度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM?DTT、100mM精氨酸、 10mM?TRIS、5mM?EDTA，pH?10且在室溫以ak_La＝0.001-0.1min^-1通 入空氣或氧氣達6-24小時；并

(c)回收所述重折疊的重組蛋白。

11.權利要求10的方法，其中所述回收步驟包括：使含有所述重組蛋白的所 述緩沖溶液澄清，并使所述重折疊的重組蛋白相繼接觸混合模式層析支 持物、陽離子層析支持物、和第一疏水層析支持物，并從每個支持物中 選擇性洗脫所述重折疊的重組蛋白。

12.權利要求11的方法，其中所述澄清步驟包括：添加去污劑至1％的終濃度， 調節pH至8.5-9.5，在25-30℃將溶液溫育1-10小時，將所述溶液離心，并 將從所述離心步驟中回收的液體過濾。