[發明專利]重組蛋白的重折疊

有效

• 申請號: 200780031808.4
• 申請日: 2007-07-13
• 公開（公告）號: CN101506222A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 謝利·皮扎羅;艾倫·桑切斯;查爾斯·H·施梅爾澤
• 申請（專利權）人: 健泰科生物技術公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 岑曉東

相關申請

本申請要求2006年7月14日提交的美國臨時申請流水號60/830,831的優 先權及權益，在此完整收錄其說明書。

發明領域

本發明涉及用于獲得在細胞培養物中生成的異源重組蛋白的方法。本發 明包括用于回收和純化重折疊的重組蛋白的方法，所述重組蛋白已經在原核 宿主細胞中生成并存在于這些細胞中，典型地存在于周質空間或胞內空間 中。所述在原核宿主細胞中生成的重組蛋白還可以作為可溶性蛋白質或者作 為可溶性蛋白質和不溶性蛋白質的混合物被發現。

發明背景

許多治療上有關的重組蛋白是在多種宿主生物體中生產的。大多數蛋白 質可以在真核宿主(諸如CHO細胞)中以它們的天然形式表達。動物細胞培 養一般要求延長生長時間以達到最大的細胞密度并最終獲得比原核細胞培 養低的細胞密度(Cleland，J.(1993)ACS?Symposium?Series?526，ProteinFolding：In?Vivo?and?In?Vitro，American?Chemical?Society)。另外，動物細胞培 養常常要求昂貴的培養基，其含有可能干擾所需蛋白質回收的培養組分 (growth?components)。細菌宿主表達系統為生產規模的重組蛋白生產提供了 有成本效益的替代方案。有許多關于重組蛋白的常規細菌表達的美國專利， 包括美國專利第4,565,785號；第4,673,641號；第4,795,706號；及第4,710,473 號。該生產方法的一個主要優點是通過離心或微濾容易地從細胞組分中分離 產物的能力。參見例如Kipriyanov和Little，(1999)Molecular?Biotechnology，12： 173-201；及Skerra和Pluckthun，(1988)Science，240：1038-1040。

然而，細菌表達系統(諸如大腸桿菌)缺乏促進蛋白質正確重折疊的細 胞機器，而且一般不導致大蛋白質分泌進入培養基。在細菌宿主細胞中表達 的重組蛋白常常被發現是包涵體，其由部分折疊的和錯誤折疊的還原的蛋白 質的密實塊組成。參見例如Baneyx，(1999)Current?Opin.Biotechnology10：411-421；及Villaverde和Carrio，(2003)Biotech.Letts.25：1385-1395。蛋白 質也可以在不形成包涵體的情況中表達。參見例如同前。典型地在包涵體中， 重組蛋白一般是無活性的。

另外，重折疊常常產生錯誤折疊的和二硫化物連接的二聚體、三聚體、 和多聚體(Morris等，(1990)Biochem.J.，268：803-806；Toren等，(1988)Anal.Biochem.，169：287-299)。這種締合現象在蛋白質重折疊過程中是非常普通 的，特別是在較高的蛋白質濃度，而且常常表現為牽涉經由部分折疊的中間 體的疏水相互作用的締合(Cleland和Wang，(1990)Biochemistry， 29：11072-11078)。