[發明專利]表達靶向內腔蛋白質的轉質體植物

無效

• 申請號: 200780025329.1
• 申請日: 2007-07-02
• 公開（公告）號: CN101484582A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: E·佩吉特;M·杜巴爾德;J·巴利
• 申請（專利權）人: 拜耳生物科學股份有限公司;中央科學研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H5/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 余 穎

本發明涉及在轉質體植物細胞的類囊體內腔(thylakoid?lumen)中表達重組 蛋白質的新構建物和方法。本發明還涉及在轉質體植物細胞中表達含二硫鍵的 感興趣蛋白質的手段和方法。

對于微生物或動物表達以產生工業或藥用重組蛋白，植物提供了合適的替 代方案。與傳統系統相比，它們提供許多優點，例如預計生產成本較低、可快 速放大、不含人病原體和能精確地折疊并裝配復雜蛋白質(Ma等，2003，Nature reviews.4：794-802)。現已成功轉化了許多模型植物以產生具有天然構象的復 雜結構，例如抗體或復雜的抗原(Warzecha和Mason，2003，J?Plant?Physiol. 160(7)：755-64；Arntzen等，2005，vaccine.23：1753-1756)。此外，一些植物 種類可能直接適用于口服免疫，即可食用疫苗的概念，包括人用疫苗(Mason 等，2002，Trends?in?MoI.Med.8(7)：324-329)。然而，因為植物的核轉化常導 致重組蛋白產率低而有一些局限性。

作為核表達的替代方案，現已出現的葉綠體遺傳工程改造是在植物中表達 重組蛋白的有效工具(Daniell等，2004，刊于molecular?Biology?of?Plant organelles(植物細胞器的分子生物學)，斯普林格公司(Springer)，443-490； Maliga?2004，Annu.Rev.Plant.Biol.55：289-313；Dubald等，2006，刊于recent Advances?in?Plant?Biotechnology(植物生物技術的最新進展)，Kumar，A.(編)， IK國際出版公司(IK?International?Publishers)，新德里(印刷中))。主要的原 因是該系統的特征在于能以極高水平(最高達可溶性總蛋白的46％)表達轉基因 (De?Cosa等，2001，Nat.biotechnol.19：71-74)。感興趣的其它特征是(i)其基 因組在大多數物種中經母系遺傳，從而極大限制了轉基因經花粉的傳播，和 (ii)通過同源重組將引入的DNA靶向整合入質體基因組的指定區域。因此， 可預測轉基因的定位，本質上是無性增殖系的所選轉基因譜系之間的基因 表達一致，并且后代中沒有特征分離。

質體是真核細胞細胞器，按照內共生理論其源自藍細菌祖先。因此，它們 仍能表現出許多原核特征，包括例如操縱子中的基因組成，和基因表達大多是 原核機制。

與其它原核系統相似，估計葉綠體不能在蛋白質水平上累積含有正確形成 的二硫鍵的重組蛋白，其代表一類重要的治療性蛋白質。迄今為止，參考文獻 中在質體中成功表達含二硫鍵的重組蛋白的例子不多(Staub，J.M.等，2000； Daniell等，2001)。然而，這些二硫鍵是否正確配對并且它們是在植物(planta) 中形成還是在提取期間自發形成并一直未能搞清楚。

就結構而言，葉綠體是復雜的細胞器，其包含三種不同的可溶相(soluble phase)。葉綠體為雙層膜的包膜(double-membrane?envelope)所包圍，該包膜封 閉形成膜間間隙(intermembrane?space)。主要的可溶相是間質，這是碳固定、 氨基酸合成和許多其它途徑的部位。主膜(dominant?membrane)是捕捉光并合 成ATP的廣泛交聯的類囊體網絡。類囊體膜密封第三可溶相，即類囊體內腔， 其中容納了許多外源性光合成蛋白質以及許多其它蛋白質(C.Robinson等， 2001，Traffic?2：245-251)。

葉綠體的類囊體內腔因為其特殊性(包括其含有特定含量的蛋白酶)而可 能是累積某些重組蛋白質的最佳植物細胞區室(Z.Adams等，TRENDS?in Plant?science(植物科學趨勢)，第7卷，第10號，第451-456頁，2002)。盡 管如此，很少考慮將其用于重組蛋白質的靶向和累積。