[發(fā)明專利]經修飾的β-內酰胺酶及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200780023477.X
• 申請日: 2007-06-19
• 公開（公告）號: CN101484577A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設計）人: 蘇珊娜·卡里艾寧;尼娜·維克斯特蘭德;佩爾蒂·科斯基
• 申請（專利權）人: IPSAT治療公司
• 主分類號: C12N9/86
• 分類號: C12N9/86;C12N1/21;A61K38/46
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉曉東;彭鯤鵬

技術領域

多種抗生素已用于治療細菌感染。然而，抗生素不僅攻擊病原體，還影響正常菌群，從而導致不良副作用的產生(例如，對患者腸道產生的副作用)。這些副作用可通過施用能夠降解腸道內殘存抗生素的酶而得到緩解。本發(fā)明涉及經修飾的金屬β-內酰胺酶，其可用于治療和預防具有β-內酰胺環(huán)的抗生素所產生的副作用，或者可用于制備這樣的酶。本發(fā)明還涉及用于制備經修飾的β-內酰胺酶的方法及可用于其中的核苷酸分子、載體和宿主細胞。

背景技術

β-內酰胺酶代表了細菌耐受β-內酰胺類抗生素(包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類)的主要機制之一。這些酶催化β-內酰胺環(huán)的酰胺鍵不可逆地水解，從而導致抗微生物試劑失效。根據分子結構類別和催化機制，β-內酰胺酶可分為四類：A、B、C和D。A、C和D類是絲氨酸酶并包含大多數β-內酰胺酶(Ambler，1980)。這些酶通常使青霉素類或頭孢菌素類失活，并常常對這兩類抗生素之一類表現出偏好性。

B類β-內酰胺酶是金屬酶，其需要一個或兩個鋅離子作為酶活性的輔因子。按照Bush-Jacoby-Madeiros功能分類(Bush，1998)，金屬β-內酰胺酶屬于第3組。這種分類模式主要基于底物特征、其對EDTA的敏感性及其對絲氨酸β-內酰胺酶抑制劑的抗性。根據配合鋅結合之區(qū)域的結構相似性，金屬β-內酰胺酶可分為三個亞組：B1、B2和B3(Galleni等，2001)。B1亞組具有三個組氨酸和一個半胱氨酸作為關鍵的鋅配合殘基。已經描述了許多B1亞組酶的晶體結構，例如蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)的BcII(Carfi等，1995和1998a)、脆弱擬桿菌(Bacteroides?fragilis)的CcrA(Carfi等，1998b)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)的IMP-1(Concha等，2000)。相應地，B2內酰胺酶亞組的主要鋅結合基序(NXHXD)中第一位殘基是精氨酸，而非組氨酸。最近，B2亞組酶的首個晶體結構(CphA)已由Garau等解析出來(Garau等，2005)。B3亞組包括多聚結構的酶(Walsh等，2005)。

金屬β-內酰胺酶顯示出廣譜的底物(其包括青霉素類和頭孢菌素類)特征，并且它們對常規(guī)的絲氨酸β-內酰胺酶抑制劑的(例如，克拉維酸、舒巴坦(sulbactam)和他佐巴坦(tazobactam))作用具有抗性。此外，與大多數絲氨酸β-內酰胺酶不同的是，金屬β-內酰胺酶具有水解碳青霉烯類(例如，美羅培南(meropenem)和泰寧(imipenem))的能力。已知多種細菌產生金屬β-內酰胺酶。其通常表達在如下細菌中：腸桿菌屬(Enterobacteriae)(包括粘質沙雷氏菌(Serratia?marcescens)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella?pneumoniae)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreudii)、弗氏志賀氏菌(Shigella?flexneri))、銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)、Stenobacterium?maltophila、不動桿菌屬(Acinetobacter)、脆弱擬桿菌(Bacteroides?fragilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)、氣味黃桿菌(Flavobacteruim?odoratum)和脆弱擬桿菌(Bacteroides?fragilis)(Walsh等，2005)。

β-內酰胺酶可用作使胃腸道中未吸收的β-內酰胺類失活的藥物蛋白質，從而防止β-內酰胺所引起的副作用(包括腸道中正常微生物環(huán)境(microbiota)的改變以及β-內酰胺抗性細菌的過度生長(WO93/13795、WO2004/016248))。為了使β-內酰胺酶治療在小腸腸道中有效地發(fā)揮作用，在存在膽汁酸的條件下該酶應能夠抵抗腸道蛋白酶的作用，并在較寬的pH值(5.5-7.5)條件下保持高的酶活性。

通過在胃腸外氨芐青霉素藥物治療期間使用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)絲氨酸β-內酰胺酶，已證實了靶向酶治療在犬和小鼠模型中的可行性(Harmoinen等，2004；Mentula等，2004；Stiefel等，2003)。然而，該酶的底物特征基本上限制了其作為藥物材料的用途，因為當β-內酰胺酶抑制劑存在時其水解頭孢菌素類、碳青霉烯類或青霉素類的能力很弱。因此，需要新的具有較寬β-內酰胺譜的蛋白酶抗性β-內酰胺酶來擴展β-內酰胺酶治療(用多種β-內酰胺類進行靜脈內藥物治療)在就醫(yī)患者中的用途。