[發明專利]用于DNA擴增反應的溶液預處理

無效

• 申請號: 200780015509.1
• 申請日: 2007-03-08
• 公開（公告）號: CN101432443A
• 公開（公告）日: 2009-05-13
• 發明（設計）人: 休·威廉·摩根;安德魯斯·瑞克特
• 申請（專利權）人: 懷卡托林克有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京高默克知識產權代理有限公司
• 代理人: 金 鳳

技術領域

本發明涉及溶液預處理。

具體而言，本發明涉及蛋白質溶液的預處理。

優選說來，蛋白質溶液用于脫氧核糖核酸(DNA)的擴增反應，所述預處理確保蛋白 質溶液中存在的任何污染性DNA不能參加DNA擴增反應。

背景技術

核酸的擴增，特別是DNA的擴增，已成為DNA分析工作中廣泛使用的工具。在只有 微小量DNA存在的情況下尤其如此。

目前，DNA擴增的最普遍使用方法是聚合酶鏈式反應(PCR)。

PCR是使用熱穩定性DNA聚合酶和兩條大約20個堿基的引物來擴增DNA堿基序列 的方法，其中一條引物互補于要擴增序列一端的(+)-鏈，而另一條引物互補于要擴增序 列另一端的(-)-鏈。

因為新合成的DNA鏈可以隨后用作相同引物序列的額外模板，引物退火、鏈延伸和分 離的連續循環，使得目標序列迅速且高特異性的擴增。

如果相關引物可以被顯影的話，PCR還可以用于檢測所定義序列在DNA樣品中的存 在。

DNA聚合酶和其他蛋白質PCR試劑被細菌性(或其他)DNA污染是PCR方法學的主 要問題。以前，這個問題已經由幾個作者提出(Bottger，1990；Rand和Houck，1990；Schmitd 等人，1991；Hughes等人，1994；Maiwald等人，1994；HiIaIi等人，1997)。

PCR擴增微小量DNA的能力是它的一個最大優勢。不過，這種能力也意味著任何痕量 的污染性DNA也一起被擴增。這種污染性DNA的擴增可能產生令人誤解的、不明確的或 者不正確的結果(Wilson等人，1990)。

具體而言，以高度保守和進化性同源真菌性核糖體的16S?rRNA基因為目標使用通用引 物來進行系統發生、進化和診斷研究的觀念，經常在PCR期間由產生假陽性而被折衷(HiIaIi 等人，1997；Corless等人，2000；Mohammadi等人，2003)。

真菌性DNA在環境中是普遍存在的，幾乎在實驗室人員處理的任何時期，也可能將污 染性DNA引入到PCR混合物中(Kitchin等人，1990；Millar等人，2002)。

DNA污染的其他源包括：氣溶膠(Saksena等人，1991)，可消耗的PCR試劑，塑料 器皿(Millar等人，2002)或商售PCR引物(Goto等人，2005)。

特別是已重復報道，可商售購得的DNA聚合酶是一種最可能的外源性細菌性DNA污 染源(Rand和Houck，1990；Bottger，1990；Schmidt等人，1991；HiIaIi等人，1997；Newsome 等人，2004)。

Schmidt等人(1991)認為，用來生產DNA聚合酶和酶純化設備(例如色譜柱)的微 生物是將外源性DNA引入到DNA聚合酶的最可能的源。

相反，兩項其他研究發現沒有證據證明：Taq-聚合酶中的外源性細菌性DNA來源于生 產性生物體，例如大腸桿菌(Escherichia?coli)或水生棲熱菌(Thermus?aquaticus)(Rand和 Houck，1990；Maiwald等人，1994)，污染性DNA被證明與熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、綠膿桿菌(Pseudomonas?aeruginosa)、糞產堿桿菌(Alcaligenes?faecalis)和棕色固 氮菌(Azotobacter?vinelandii)最為相關(Maiwald等人，1994)。

此外，Schmidt等人(1991)也已經檢測到，污染性DNA來源于各批Tag-聚合酶制劑 中的真核生物。

可是這些研究不考慮源，而是致力于強調外源性DNA普遍存在于可商售購得的Tag- 聚合酶制劑中。