[發明專利]評估解凍細胞的存活能力的方法

無效

• 申請號: 200780010271.3
• 申請日: 2007-01-26
• 公開（公告）號: CN101405387A
• 公開（公告）日: 2009-04-08
• 發明（設計）人: 亨利·J·利斯;弗蘭切斯卡·D·霍頓
• 申請（專利權）人: 諾沃塞勒斯有限公司
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08;G01N33/50
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 史 悅

本發明涉及評估解凍細胞存活能力(viability)的方法。

為了IVF過程中的成功率，刺激卵巢以產生多于一個的卵母細胞 (oocyte)。結果，大多數IVF周期導致胚胎(embryo)的總數超過了用于在單個 周期中轉移至個體患者的最適量(optimum)。對此問題合乎倫理和經濟的方法 是胚胎冷藏(cryopreservation)。胚胎冷藏允許儲藏特大數量的(supernumeracy) 優質胚胎直至它們能在后面的周期中被轉移，從而減少了達到懷孕所需的刺 激卵巢藥物處理周期的數目，并因此減少了患卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation?syndrome)的風險(Trounson，1986)，且提供了對多胎妊娠的防 止。冷藏還允許在自發排卵周期或者雌激素和孕酮激素水平不超過天然存在 的水平的周期中替換(replacement)解凍的胚胎，因此增加了每個患者的懷孕 率。大多數的輔助受孕單位常規地提供前核的或早期卵裂期(early?cleavage stage)的胚胎的冷藏。

利用了速度受控冷凍技術：在冷凍保護劑流體中緩慢冷卻胚胎，從體溫 降至-196℃(此處所有的細胞過程停止)，在該溫度將它們儲藏于液氮容器 中。所述的冷凍保護劑用于保護細胞免受損害。當將這些細胞解凍時，從液 氮中取出它們，解凍，除去冷凍保護劑，和培養細胞。導致細胞損害以及危 害解凍后功能和發育的幾個因素與冷卻和冷藏有關。細胞損害可由細胞內冰 (intracellular?ice)的形成然后該細胞內冰的快速冷卻引起；細胞外冰的形成也 導致在未結冰部分電解質濃度的增加以及細胞脫水。利用膜溶質相互作用 (membrane?solute?interaction)的體外模型檢測到：脫水和復水(re-hydration)導 致脂質膜上的機械應力并引起物理變形和相(phase)行為的改變。這些物理改 變可在多種程度影響細胞：可改變細胞膜和細胞器；已顯示圍繞胚胎的透明 帶(zona?pellucida)在冷藏過程中遭受(一定量的)硬化，以及紡錘體進而染色體 分離會受到損害。近來，已顯示一些基因受到冷凍和解凍過程的誘導，這說 明該細胞積極響應刺激(insult)。與冷凍保護劑組合的緩慢冷凍允許通過減少 細胞內冰和減少溶質濃度增加的影響來保護細胞免于上述有害的機制 (mechanism)。所述細胞外冰驅動細胞經由平衡過程脫水。更快速的方法，即 玻璃化(vitrification)，使用高濃度(high?level)的冷凍保護劑和非常快速的冷 卻，以使細胞內冰的形成最小化。它是非平衡方法。

冷凍和冰形成導致雙層(即兩層)脂質膜的脫水。借助冷凍(with?freezing) 液體結晶至凝膠的相變導致磷脂的烴尾部的有序化成為更加緊密的和平行 的陣列，這可引起對水和陽離子的滲透性增加、整合膜蛋白的分離、膜結合 酶的活性降低、蛋白質的徑向擴散的降低。精子和卵母細胞很可能經歷類似 的作用，盡管它們的脂質構成非常不同。成熟卵母細胞具有位于減數分裂的 紡錘體處的微管。將溫度降至25℃于10分鐘使微管破裂，而且完全分裂 (dissolution)發生于0℃。在小鼠中重新升溫導致微管的重建，但是這不發生 于人中，因為缺乏成核細管聚合(nucleate?tubule?polymerization)所需的中心粒 旁物質。因紡錘體解體，所得的卵母細胞往往可以具有非整倍性(aneuploidy) (即染色體數目異常)。冷凍還可通過降低透明帶的胰凝乳蛋白酶敏感性和皮 質顆粒(cortical?granule)而影響受精。實際上殼可能太“堅硬”。Linford和 Meyers使用單細胞凝膠電泳顯示精子可能受到損傷。線粒體也易受冷藏損 傷。在冷藏和隨后的培養過程中，卵母細胞DNA的退化似乎涉及細胞凋亡 (apoptosis)過程，并檢測到典型標記(classic?markers)和胱天蛋白酶(caspase)。 因此細胞經歷程序性細胞死亡。感興趣的是，還激活了與應激反應有關的基 因，包括與熱休克蛋白、氧化應激清除劑(scavenger)和涉及葡萄糖代謝的酶 有關的基因。