[發(fā)明專利]利用骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)獲得內(nèi)耳毛細胞前體的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710308076.0
• 申請日: 2007-12-31
• 公開（公告）號: CN101215546A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐婭蘋;管明;雷云秋;彭佳萍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種利用骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)獲得內(nèi)耳毛細胞前體的方法，所述方法是將分離提純的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)，取穩(wěn)定傳代的骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)7～20天，獲得內(nèi)耳毛細胞前體；所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為添加有生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述生長因子主要包括表皮生長因子和胰島素樣生長因子-1，添加量為：EGF?10～30ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IGF-140～60ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、全反式維甲酸的組合，添加量為：EGF?10～30ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IGF-140～60ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，BDNF?10～30ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ZTRA0.5～2×10^-8mol/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法按如下步驟進行：(1)將分離提純的骨髓間充質(zhì)干細胞在在MSC培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，使骨髓間充質(zhì)干細胞傳代，獲得穩(wěn)定的傳代的骨髓間充質(zhì)干細胞；(2)經(jīng)消毒處理的蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被后作為用于細胞爬片的備用蓋玻片；(3)待步驟(1)的骨髓間充質(zhì)干細胞傳代傳至第3代時，用0.25％胰蛋白酶消化貼壁細胞，離心后用MSC培養(yǎng)液重懸，得到細胞懸液，調(diào)整細胞懸液中骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞濃度為1×10⁵～2×10⁵/ml，將細胞懸液滴加于所述備用蓋玻片上，覆蓋上表面，蓋玻片周邊滴加基礎(chǔ)培養(yǎng)基覆蓋，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，細胞即在蓋破片中生長，為第4代細胞；(4)待細胞生長覆備用蓋玻片表面50％～60％時，傾去MSC培養(yǎng)液，加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)7～20天，獲得內(nèi)耳毛細胞前體。

4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含2％胎牛血清和1％N2輔劑的低糖DMEM液。

5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：將所述骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)傳代至第4代后，再添加生長因子進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述傳代培養(yǎng)在低糖DMEM液與胎牛血清液體積比250∶44.117的混合溶液中進行。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子和胰島素樣生長因子-1的組合，添加量為：EGF?20ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IGF-150ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、全反式維甲酸的組合，添加量為：EGF?20ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IGF-150ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，BDNF?20ng/mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ZTRA?1×10^-8mol/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述骨髓間充質(zhì)干細胞分離提純方法如下：取4～5周齡SD大鼠，脫頸處死，消毒后取出股骨，將股骨剪開，用低糖DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心，取沉淀，用15％干細胞培養(yǎng)液重懸，37℃、5％CO₂條件下于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)10～16h，傾去未貼壁細胞，加入0.01MPBS去除貼壁不牢固細胞，再用0.01M?PBS洗滌后，加入15％干細胞培養(yǎng)液，37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)獲得純化的骨髓間充質(zhì)干細胞。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述15％干細胞培養(yǎng)液為低糖DMEM液與胎牛血清液體積比250∶44.117的混合液。