[發明專利]利用骨髓間充質干細胞誘導獲得內耳毛細胞前體的方法

無效

• 申請號: 200710308076.0
• 申請日: 2007-12-31
• 公開（公告）號: CN101215546A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 徐婭蘋;管明;雷云秋;彭佳萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術領域

本發明涉及一種利用骨髓間充質干細胞誘導獲得內耳毛細胞前體的方法。

(二)背景技術

感音性神經性耳聾(sensorineural?hearing?loss)在臨床上很常見，最新報道達數十億人，占人口總數的10％左右。在歐美就超過9億人。主要是因為內耳毛細胞數量有限，只有大約1500個；易受衰老、噪聲、耳毒性藥物、外傷、感染、腫瘤、遺傳性疾病、免疫性疾病等體內外因素的影響而損傷或破壞；且哺乳動物耳蝸毛細胞破壞后再生能力有限，常可引起永久性的聽力下降，治療非常困難。隨著干細胞研究的深入，通過干細胞移植或再生補償毛細胞的損失，是迄今研究最活躍的領域之一。

干細胞按其細胞來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞通常是指源自囊胚內細胞團的細胞，在一定條件下可向內、中、外三個胚層的組織和細胞分化，同時具有無限擴增的能力。成體干細胞是指存在于成年動物許多組織和器官，具有修復和再生能力的細胞。目前發現有成體干細胞的組織類型有10多種，如心臟、骨髓、腦、肝、視網膜等。

胚胎干細胞在體內外均可以分化為內耳毛細胞。Li等將胚胎干細胞進行體外誘導分化培養，發現培養至第八天，細胞表達神經前體細胞特異性蛋白nestin和毛細胞前體細胞特異性蛋白Pax2；繼續培養10～14天，這些細胞表達內耳成熟毛細胞的標志物。將體外培養的毛細胞前體細胞注入到胚胎的聽泡中，幾天后細胞遷移到內耳毛細胞區，并分化為成熟的毛細胞。

神經干細胞是成體干細胞的一種，可以在體內外分化為毛細胞。Kojima等最先報道神經干細胞在體外培養，可以誘導分化為毛細胞。Ito等將神經干細胞經蝸壁、園窗或卵園窗注入耳蝸發現神經干細胞遷移至柯替氏器毛細胞的表面，并具有內毛或外毛細胞的形態。

胚胎干細胞和神經干細胞在體內外誘導分化為內耳毛細胞的成功，為干細胞移植治療感音神經性耳聾提供了堅實的基礎。但是，胚胎干細胞和神經干細胞取材困難，受到醫學倫理學和法律的制約，很難在臨床推廣應用。

骨髓間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells?MSCs)是骨髓中除了造血干細胞以外的另一類成體干細胞，這類細胞具有高度自我更新和多向分化的潛能。在不同條件下骨髓間充質干細胞可以定向誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、心肌細胞、肝細胞。MSC是自體組織，來源廣泛，分離培養容易，免疫源性弱，是用于體內相關疾病的細胞替代治療的理想靶細胞。

2000年Li等將MSC直接注入大腦中動脈閉塞的大鼠紋狀體內，28d后觀察到MSC不僅在腦內成活，而且向缺血區遷移，部分細胞表達神經細胞的特異性蛋白。2001年Lu等將MSC從靜脈植入大鼠腦外傷模型內，發現MSC植入能夠使腦外傷后的各種神經功能障礙得到改善。2000年Brazelton和Mezey以不同的方式證實，外源性的MSC注入小鼠腦內可以轉化為神經元。2003年張杰等對Wistar大鼠骨髓間充質干細胞視網膜下移植的研究發現，MSC能夠在視網膜下存活，并能與原視網膜結構相融合。可以認為MSC是神經移植的理想供體。尤其是骨髓間充質干細胞誘導分化為神經前體細胞、神經元和神經膠質細胞的實驗引起了我們的興趣。Kopen等首先報道小鼠MSCs注入新生小鼠側腦室后，MSCs遷徙經過前腦、小腦，在紋狀體、海馬中分化為成熟的神經膠質細胞，在腦干的網狀結構中分化為神經元。Woodbury等以β2巰基乙醇、二甲基亞砜和叔丁基羥基茴香醚誘導骨髓MSCs，結果約50％～80％分化為神經元。骨髓間充質干細胞能誘導分化為神經細胞，而神經干細胞又能在一定條件下分化為毛細胞，那么骨髓間充質細胞向內耳毛細胞的誘導分化就很值得研究。

但目前仍需解決以下問題：(1)再生的骨髓MSC是否有成熟細胞的功能；(2)再生的骨髓MSC是否有效地與周圍組織細胞結構相融合并加入到神經環路中；(3)如何提高骨髓MSC在體內的成活率和誘導定向分化能力；(4)骨髓MSC移植的安全性等。通過國內外文獻檢索，尚未有關于骨髓間充質干細胞移植在耳蝸損傷中應用的相關研究報道。目前尚未見體外培養骨髓MSC定向誘導分化為耳蝸感覺上皮細胞的報道，其關鍵是要找到合適的誘導因子。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種利用骨髓間充質干細胞誘導獲得內耳毛細胞前體的方法。

本發明采用的技術方案是：