[發明專利]利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法

無效

• 申請號: 200710308075.6
• 申請日: 2007-12-31
• 公開（公告）號: CN101215545A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 徐婭蘋;管明;雷云秋;彭佳萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術領域

本發明涉及一種利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法。

(二)背景技術

骨髓間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)除參與構成支持造血的微環境外，還具有強大的自我復制能力和多向分化潛能，不同的體外誘導條件可以決定其分化方向，可能是這些誘導條件啟動了決定分化方向的轉錄因子。而將MSCs通過靜脈途徑或局部注射移植到體內不同的組織時，即可在相應的組織內分化形成該類組織細胞。長期以來神經系統損傷后神經細胞的再生移植困擾著人們，胚胎神經干細胞移植可促進神經損功能的恢復，但因倫理問題限制了其應用。MSCs具有來源豐富，不涉及倫理問題等優點，可能為神經系統疾病的治療提供新途徑。

盡管目前已有報道MSCs具有向神經細胞分化的潛能，但誘導體系仍需要改善，系統重復性較差或者細胞誘導后活性不良，最終不能獲得功能細胞。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種系統重復性好的利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法。

本發明采用的技術方案是：

一種利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法，所述方法是將分離提純的骨髓間充質干細胞經傳代培養，取穩定傳代的骨髓間充質干細胞轉入誘導培養基，誘導培養7～20天，獲得神經前體細胞；所述的誘導培養基為添加有生長因子的基礎培養基，所述生長因子主要包括表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、神經營養因子3(NT-3)，添加量為：EGF?10～30ng/mL基礎培養基，bFGF?5～20ng/mL基礎培養基，IGF-140～60ng/mL基礎培養基，NT-310～30ng/mL基礎培養基。

所述生長因子也可為表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、腦源性神經營養因子(BDNF)和神經營養因子3(NT-3)的組合，添加量為：EGF?10～30ng/mL基礎培養基，bFGF?5～20ng/mL基礎培養基，IGF-140～60ng/mL基礎培養基，BDNF?10～30ng/mL基礎培養基，NT-310～30ng/mL基礎培養基。

骨髓間充質干細胞來源廣泛，取材方便，不受醫學倫理學和法律的制約；且骨髓間充質干細胞能抑制T淋巴細胞成熟和增殖，移植后具有逃避免疫排斥反應的特點。因此若骨髓間充質干細胞能被誘導分化神經前體細胞進一步轉化為內耳毛細胞，將很好的解決干細胞移植治療感音神經性耳聾的細胞來源問題。

本發明采用貼壁法提取骨髓間充質干細胞，體外培養純化后，選取表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3(NT-3)組合成不同的誘導條件，加入骨髓間充質干細胞基礎培養液中，誘導骨髓間充質干細胞分化。在誘導過程中，觀察細胞形態變化，并用免疫細胞化學方法檢測神經前體細胞或神經元細胞特異抗原：nestin、P27是否在誘導后的細胞表達，從而鑒定骨髓間充質干細胞能否被誘導分化為神經前體細胞，試圖為干細胞移植治療感音神經性耳聾提供實驗基礎，并有較高先進性和重要臨床意義。經篩選，EGF+bFGF+IGF-1+NT-3的組合或者EGF+IGF-1+bFGF+BDNF+NT-3的組合，被認為是骨髓間充質干細胞分化為神經前體細胞的最佳誘導分化條件。

所述誘導培養所用培養基為本領域常用于骨髓間充質干細胞誘導培養的基礎培養基，本發明中，所述基礎培養基為含2％優級胎牛血清和1％N2輔劑的低糖DMEM液。所述基礎培養基具體配制方法為：每100mL低糖DMEM液，加入2g胎牛血清和1g?N2輔劑。

本發明將所述骨髓間充質干細胞培養傳代至第4代后，再添加生長因子進行誘導培養。實驗發現，P6期后，部分細胞失去典型的長梭形細胞樣，變寬大，呈三角形，多邊形，增殖速度開始變緩，傳代間隔時間變長。2004年，Oswald等同樣發現骨髓間充質干細胞在P6代后細胞逐漸變寬大，實驗證實了這一結果。在傳代過程中，干細胞可能在進行自發的分化，傳代次數越多，越失去干細胞性。國外報道骨髓間充質干細胞可傳代至30代以上，但此時干細胞特性值得懷疑。干細胞特性的維持可能與營養條件密切相關，同時需注意避免培養過程中理化因素對骨髓間充質干細胞的損害，如傳代過程中，需注意控制胰酶消化時間，及注意吹打細胞時的輕柔。本發明只挑選P4代細胞作為處理細胞，因為此代細胞，干細胞特性維持良好，且已基本純化。