[發明專利]利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法

無效

• 申請號: 200710308075.6
• 申請日: 2007-12-31
• 公開（公告）號: CN101215545A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 徐婭蘋;管明;雷云秋;彭佳萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種利用骨髓間充質干細胞誘導獲得神經前體細胞的方法，所述方法是將分離提純的骨髓間充質干細胞經傳代培養，取穩定傳代的骨髓間充質干細胞轉入誘導培養基，誘導培養7～20天，獲得神經元樣細胞；所述的誘導培養基為添加有生長因子的基礎培養基，所述生長因子主要包括表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1和神經營養因子3；添加量為：EGF?10-30ng/mL，bFGF?5-20ng/mL，IGF-140-60ng/mL，NT-310-30ng/mL。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1、腦源性神經營養因子和神經營養因子3的組合；添加量為：EGF?10-30ng/mL，bFGF5-20ng/mL，IGF-140-60ng/mL，BDNF?10-30ng/ml，NT-310-30ng/mL。

3.如權利要求1或2所述的方法，所述方法按如下步驟進行：(1)將分離提純的大鼠骨髓間充質干細胞在在MSC培養基中傳代培養，使骨髓間充質干細胞傳代，獲得穩定的傳代的骨髓間充質干細胞；(2)經消毒處理的蓋玻片經多聚賴氨酸包被后作為用于細胞爬片的備用蓋玻片；

(3)待步驟(1)的骨髓間充質干細胞傳代傳至第3代時，用0.25％胰蛋白酶消化貼壁細胞，離心后用MSC培養液重懸，得到細胞懸液，調整細胞懸液中骨髓間充質干細胞的細胞濃度為1×10⁵～2×10⁵/ml，將細胞懸液滴加于所述備用蓋玻片上，覆蓋上表面，蓋玻片周邊滴加基礎培養基覆蓋，在37℃、5％CO₂條件下培養，細胞即在蓋破片中生長，為第4代細胞；(4)待細胞生長覆備用蓋玻片表面50％～60％時，傾去MSC培養液，加入誘導培養基，在37℃、5％CO₂條件下培養，培養7～20天，獲得神經前體細胞。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基礎培養基為含2％胎牛血清和1％N2輔劑的低糖DMEM液。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：將所述骨髓間充質干細胞培養傳代至第4代后，再轉入誘導培養基中進行誘導分化培養。

6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述傳代培養在低糖DMEM液與胎牛血清液體積比250∶44.117的混合溶液中進行。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1和神經營養因子3的組合，添加量為：EGF?20ng/mL，bFGF?10ng/mL，IGF-150ng/mL，NT-320ng/mL。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1、腦源性神經營養因子和神經營養因子3的組合，添加量為：EGF?20ng/mL，bFGF?10ng/mL，IGF-150ng/mL，BDNF?20ng/mL，NT-320ng/mL。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述骨髓間充質干細胞來自SD大鼠，分離提純方法如下：取4～5周齡SD大鼠，脫頸處死，消毒后取出股骨，將股骨剪開，用低糖DMEM液反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心，取沉淀，用15％干細胞培養液重懸，37℃、5％CO₂條件下于培養瓶中培養10～16h，傾去未貼壁細胞，加入0.01M?PBS去除貼壁不牢固細胞，再用0.01M?PBS洗滌后，加入15％干細胞培養液，37℃、5％CO₂條件下培養獲得純化的骨髓間充質干細胞。

10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述15％干細胞培養液為低糖DMEM液與胎牛血清液體積比250∶44.117的混合液。