[發明專利]一株對氧還循環反應劑高敏感的大腸桿菌的構建及應用

無效

• 申請號: 200710305387.1
• 申請日: 2007-12-25
• 公開（公告）號: CN101469317A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 呂建新
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/63;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明要求保護的技術方案涉及一種通過分子生物學手段，利用代謝工程改造的細菌，具體的說是一株對氧還循環反應劑高敏感的大腸桿菌菌株、構建方法及其在檢測氧還循環反應劑的生物傳感器研究中的應用。

背景技術

研究顯示，氧化應激參與了神經退行性變、癌癥和衰老等的發生過程。其中，主要因素之一就是氧還循環反應劑(redox?cycling?reagents)，這類物質在細胞內經過氧化還原循環反應產生活性氧簇(ROS)而參與上述疾病的發生發展。氧還循環反應劑在一些酶的催化下，被還原當量NADH/NADPH所還原發生單電子傳遞反應，將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子(見圖1)。超氧陰離子產生的過程是：(1)在硫辛酸脫氫酶的催化下，氧還循環反應劑(R⁺⁺)被還原(R⁺)；(2)被還原的氧還循環反應劑(R⁺)將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子，而本身又被重新氧化為原來的狀態(R⁺⁺)。硫辛酸脫氫酶是一類普遍存在的黃素酶，在大腸桿菌中至少有三種這類酶，其中的兩種酶已經被鑒定，它們是：硫氧還蛋白還原酶和NADPH：鐵氧還蛋白還原酶。在哺乳動物細胞這類酶主要包括：微粒體NADPH-細胞色素P-450還原、黃素嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶。上述網絡反應就是在硫辛酸脫氫酶和氧還循環反應劑的催化下，NADPH迅速氧化分子氧生成超氧陰離子。總之，細胞暴露在氧還循環反應劑下有兩個主要的后果：1)細胞內大量還原當量NAD(P)H的消耗；2)細胞內過氧化物的大量生成。

氧還循環反應劑是主要的工農業污染物之一，對于工農業污染物的監測已經發展了一些物理化學方法，質譜儀、氣相色譜儀及其它現代化的儀器無疑為污染物的精確監測提供了強有力的技術，但是，這些物理化學方法需要昂貴的儀器和專門的實驗室，更重要的是，這些技術雖說能夠精確定量污染物，但是不能提供這些污染物的生物有效度、細胞內潛在的修飾/去毒作用以及體內的協同/拮抗效應等生物學關鍵信息。因此，有必要發展一種生物傳感器來對這些有毒物質進行檢測。在過去的十幾年里，利用生物檢測技術來檢測特殊污染物的研究引起了廣泛的關注，生物檢測技術的基本原理即是利用模式生物對特定化學物質的分子反應機理。對于生物檢測技術而言需要三種必需的元件：1)針對特定或具有相似性質的化學物質的感應器；2)由感應器控制的啟動子；3)受此啟動子控制的報告基因。在設計生物檢測技術時，由于細菌具有在環境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優點而受到研究人員普遍親睞。至今，已經研發了一系列針對特定有機物和無機化合物如：重金屬、甲苯及其衍生物和其它物質檢測的生物傳感器。

現在已經比較清楚大腸桿菌針對氧還循環反應劑反應的分子機理。兩種氧還反應轉錄因子，SoxR和OxyR，主要負責介導細胞對氧還循環反應劑的反應。SoxR包含兩個結構域：N端螺旋-轉折-螺旋DNA結合域和C端的調節域。SoxR?C端的四個半胱氨酸殘基(Cys)作為鐵硫中心(2Fe-2S)的配體。純化的SoxR是一同源二聚體，每一單體包含一個鐵硫中心(2Fe-2S)。在普通培養條件下，細菌中SoxR(2Fe-2S)處于還原狀態，無任何轉錄活性。當在培養基中加入氧還循環反應劑時，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目標基因soxS的表達。其產物SoxS是Ara-C相關轉錄激活子，能誘導36種基因的表達，其中包括含有Mn-超氧化物歧化酶(SODA)、核酸內切酶IV、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、延胡索酸酶C、烏頭酸酶A和NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶等基因。

OxyR是大腸桿菌中另一種主要的氧還轉錄因子。與SoxR不同，OxyR含有兩個氧還活性半胱氨酸殘基(Cys199和Cys208)。OxyR氧化和還原狀態的調節域的晶體結構顯示這兩個氧還活性半胱氨酸殘基之間大約相隔17。在氧化狀態下，二硫鍵的形成導致OxyR調節域結構的顯著改變。OxyR二硫鍵可逆的形成被認為代表細胞內感受過氧化氫的一種機制，然而，也有人認為OxyR有其它的激活機制。因為部分由氧還循環反應劑刺激細胞產生的超氧陰離子被轉化為過氧化氫，所以OxyR在大腸桿菌內也被氧還循環反應劑所激活。活化的OxyR刺激一大類基因的表達，其中包括過氧化氫酶I(katG)、谷氨酰氧還蛋白I(grxA)、烷基過氧化氫還原酶大亞單位(ahpF)和鐵氧還蛋白2(trxC)等基因。