[發明專利]一株對氧還循環反應劑高敏感的大腸桿菌的構建及應用

無效

• 申請號: 200710305387.1
• 申請日: 2007-12-25
• 公開（公告）號: CN101469317A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 呂建新
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/63;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種對于氧還循環反應劑敏感的大腸桿菌菌株，其特征在于，名稱為E.coli?WMC-001，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，普通微生物中心，編號CGMCC?No.1867。

2.根據權利要求1所述的對于氧還循環反應劑高敏感的大腸桿菌菌株E.coli?WMC-001，其特征在于，該菌為多基因突變株。

3.根據權利要求2所述多基因突變菌株，其特征在于，利用基因敲除技術，敲除E.coli?MC4100基因組中編碼分解超氧化物的酶(sodA和sodB)和分解過氧化物和過氧化氫的酶(katG和ahpCF)及生成內源性超氧化物和過氧化氫的酶(frdABCD)。

4.根據權利要求3所述多基因突變株的構建方法，其特征在于，利用條件復制質粒pKOV作為工具，重組頻繁的E.coli?MC4100為研究對象，通過同源重組的方法順序敲除frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA。

5.根據權利要求4所述多基因突變株的構建方法，其特征在于，重組片斷的構建利用交叉PCR擴增出含有基因兩端同源臂的PCR片斷，frdABCD?PCR片斷構建。

6.根據權利要求4所述五個基因的敲除的方法，其特征在于，用于基因敲除的打靶載體，包括pKOV-sodA、pKOV-sodB、pKOV-katG、pKOV-ahpCF及pKOV-frdABCD，，其中以pKOV-frdABCD為例其載體構建。

7.根據權利要求4所述多基因突變株的構建方法，其特征在于，基因敲除的步驟以frdABCD的敲除為例：將權利要求5所述打靶載體pKOV-frdABCD轉化入E.coli?MC4100，通過兩次同源重組，最后將frdABCD替換。

8.根據權利要求3、4、5、6、7所述多基因突變株的構建方法，其特征在于，利用同樣的原理，依次將frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA敲除，最終形成frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA五個基因缺失的多基因突變菌株，命名為E.coli?WMC-001。

9.根據權利要求8所述構建的多基因突變株E.coli?WMC-001，其特征在于，這個菌株對于典型氧還循環反應劑百草枯(paraquat，PQ)、維生素K3(vitamin?K-3，VitK3)和吩嗪硫酸甲酯(phenazine?methosulfate，PMS)的敏感性明顯高于野生菌MC4100，并且在幾個突變菌株中E.coli?WMC-001的敏感性是最高的。

10.根據權利要求9所述對于氧還循環反應劑高敏感突變菌株E.coli?WMC-001，其特征在于，這個敏感菌株的構建解決了生物監測氧還循環反應劑時細菌本身靈敏度不高的問題，能夠在靈敏地檢測氧還循環反應劑的生物傳感器的研究中得到應用。