[發明專利]豬囊尾蚴病重組基因、疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 200710305254.4
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101275140A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 才學鵬;丁軍濤;王穎;陳曉宇;駱學農;鄭亞東;景志忠
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/30
• 分類號: C12N15/30;C12N15/10;C12N15/63;A61K48/00;A61P33/02
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因、這種重組基因的制備方法、這種重組基因的用途，特別是采用這種重組基因制備的用于防治豬囊蟲病的口服疫苗和制備這種疫苗的制備方法。

背景技術

豬帶絳蟲病(Taeniasis?solium)是一種世界性分布的人獸共患病，豬帶絳蟲的蟲卵六鉤蚴(oncosphere)被豬或野豬等中間宿主吞食后發育成豬帶絳蟲的幼蟲囊尾蚴(Cysticercus?cellμlose)，人誤食感染囊尾蚴的豬肉或接觸被囊尾蚴污染的物品后極易感染豬帶絳蟲病。因此，豬囊尾蚴病不僅對畜牧業造成經濟損失，嚴重影響肉品的質量，更重要的嚴重危害人類的健康，囊蟲病已引起了世界各國政府的普遍關注和高度重視，如何有效地控制和消滅囊蟲病是關注的焦點。

目前關于囊蟲病的防治還沒有成熟的手段，幾種化學藥物對囊蟲病的治療曾起過重要作用，如苯硫咪唑、吡喹酮對囊蟲有很好的驅除和治療作用，但隨著人們長期反復的使用，藥物治療引起的副作用和食品中藥物殘留對人體可能造成的危害已顯示出單獨藥物治療的局限性。分子生物學和免疫學的迅速發展及各種新技術的出現和應用極大地推動了新型疫苗的研究，研究新的疫苗載體、探討新的疫苗形式，以獲得安全、穩定、有效的新型疫苗成為人們關注的熱點。

中國發明專利申請200410065671.2公開了一種用作預防豬囊蟲病的基因工程疫苗及其制備方法。該疫苗是以乙肝病毒的核心蛋白或乙肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位氨基酸全第1?83位氨基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗；其制備方法是以乙肝病毒核心蛋白為載體，在乙肝病毒核心蛋白(HBe)基因的第1位氨基酸至第：1?83位氨基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒或真核表達質粒上，轉化宿主菌，經誘導目的基因表達、獲得目的蛋白或柱純化真核表達質粒DNA，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因，預期這種重組基因對對豬囊蟲病的預防與治療有積極的作用；本發明的第二個目的是提供這種豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因的制備方法；本發明的第三個目的是提供一種利用本發明公開的豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因制備用于治療或預防豬囊蟲病的藥物或疫苗，特別是一種可以口服使用的、有較好免疫作用的疫苗以及這種疫苗的制備方法。

本發明的重組基因是將豬帶絳蟲六鉤蚴的TsoL18基因原始序列中的第1至第48位信號肽堿基全部去除，并將截去信號肽的TsoL18基因序列中的第12位堿基a突變為t、第333位堿基a突變為c、第335位堿基a突變為c、第336位堿基a突變為t。

本發明的豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因的一種制備方法是取豬帶絳蟲末端成熟的孕卵節片，從中取出孵化和激活的六鉤蚴，提取六鉤蚴的總RNA，以六鉤蚴的總RNA為模板進行RT-PCR，制備TsoL18目的基因，采用的上、下游引物分別是：

上游引物P1：

下游引物P2：

本發明的豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因可以用于制備防治囊蟲病的藥物或者用于制備防治囊蟲病的疫苗。其一個具體的實施例是制備一種可口服使用的防治囊蟲病的疫苗，這種疫苗是含前述的豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌細胞，其中所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌攜帶有豬帶絳蟲六鉤蚴TsoL18重組基因，并且該基因能夠在減毒鼠傷寒沙門氏菌內和/或沙門氏菌寄生的免疫效應細胞內表達。

上述的防治豬囊蟲病的口服疫苗的制備方法是將本發明的豬帶絳蟲六鉤蚴重組基因與沙門氏菌表達載體pYA3342連接構建重組表達載體pYA3342-TsoL18，電轉化大腸桿菌X6212，得到X6212(pYA3342-TsoL18)，從其提取重組質粒，CaCl₂法轉化沙門氏菌中間宿主X3730，使重組質粒獲得鼠傷寒沙門菌的甲基化模式，再從X3730菌中分離重組質粒，電轉化終宿主疫苗株X4550，得到重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)，即本發明的疫苗。