[發明專利]一種阿魏酸酯酶活性的檢測方法

無效

• 申請號: 200710304762.0
• 申請日: 2007-12-29
• 公開（公告）號: CN101216421A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 楊紅建;岳群
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12Q1/44;G06F19/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明屬于酶工程領域，具體地，涉及一種通過測定反應體系的OD值檢測阿魏酸酯酶活性的方法。

背景技術

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被稱為肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物細胞壁中羥基肉桂酸和糖之間酯鍵的一類酶，其催化的主要反應為：多糖～阿魏酸酯+H₂O＝阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。

阿魏酸酯酶在造紙、食品、制藥及飼料工業有很廣泛的應用空間。近年來，阿魏酸酯酶在飼料消化中的作用日益引起人們的關注。秸稈和飼草干物質中約30％～80％為細胞壁成分，然而，反芻動物對這些細胞壁的消化利用率不超過50％。因此，細胞壁成為秸稈和飼草利用的瓶頸因素。

阿魏酸酯酶可以打開飼料細胞壁木質素中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網狀交聯結構，從空間上增加瘤胃微生物對細胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測認為是消除細胞壁降解限制因子的關鍵酶之一。

多種天然和合成底物被用來檢測阿魏酸酯酶的活性，如脫淀粉小麥麩、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酰基寡糖等。根據底物利用數據及一級序列同一性，阿魏酸酯酶已被分為4個亞類，type～A、B、C、D。這4類阿魏酸酯酶均可水解最簡單的底物阿魏酸甲酯，釋放出的阿魏酸通常經由HPLC、GC或分光光度計進行檢測。

但是HPLC和GC所需儀器設備昂貴，操作復雜，花費較高，應用分光光度計進行檢測相對成本較低，但這三種方法對樣品的需要量都較大，步驟繁瑣，費時費力。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速簡便、可用于大量樣品檢測的阿魏酸酯酶活性檢測方法。

為了實現本發明的目的，本發明的一種阿魏酸酯酶活性檢測方法，其步驟包括：將待測酶液與阿魏酸甲酯溶液混合，進行反應，檢測OD值，計算酶活性。

所述的待測酶液的制備步驟包括：在96孔板上每孔加入50～100μL適當稀釋9～1600倍的待測酶液，35～65℃預熱10～30分鐘。優選地為39℃預熱15分鐘。

所述的阿魏酸甲酯溶液的制備步驟包括：稱取適量104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml無水乙醇中，用100mM?MOPS緩沖液(pH4.5～7)稀釋至50～200μM，35～65℃預熱10～30分鐘。優選的為稀釋至100μM，pH為6.0，預熱為15分鐘。所述的反應溫度為35～65℃，反應時間依據樣品活性而定，一般為10～30分鐘。

所述的OD值是在340nm下用酶標儀檢測。

所述的一種阿魏酸酯酶活性檢測方法，具體包括如下步驟：

(1)稱取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml無水乙醇中，用100mM?MOPS緩沖液(pH4.5～7)稀釋至50～200μM，35～65℃預熱10～30分鐘，得到阿魏酸甲酯溶液；

(2)在96孔板上每孔加入適當稀釋6～1600倍的待測酶液，35～65℃預熱10～30分鐘，得待測酶液；

(3)在步驟(2)的待測酶液中，在48個孔中加入步驟(1)的阿魏酸甲酯溶液，35～65℃反應10～30分鐘，使用酶標儀在340nm檢測反應體系在反應起始及終止時的OD值；用100mM?MOPS緩沖液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作為酶空白加入其余的48個孔中；

(4)通過如下公式計算阿魏酸酯酶的活性：

其中OD_反應起始：反應起始反應體系的OD值；

OD_反應終止：反應終止反應體系的OD值；

OD_{酶空白起始}：不加待測酶反應起始反應體系的OD值；

OD_{酶空白終止}：不加待測酶反應終止反應體系的OD值；

V_體系：反應體系的總體積；

l：光程厚度(cm)

ε_{阿魏酸甲酯}：阿魏酸甲酯的消光系數；

ε_阿魏酸：阿魏酸的消光系數；

V_樣品：待測酶液的體積。

其中，待測酶液與阿魏酸甲酯溶液的體積比為50～100∶100～200；優選地為100∶200。其中，步驟(1)、(2)和(3)中預熱溫度及反應溫度應一致。

本發明的檢測方法可用于阿魏酸酯酶酶制劑活性的批量檢測，在飼料業、造紙業、制藥業、香料生產中具有較高的實際應用價值。酶活定義：一定溫度下，每分鐘由阿魏酸甲酯釋放出1uM阿魏酸所需酶量為1U，U/mL。