[發(fā)明專利]一種用于肝臟損傷和肝硬化的細(xì)胞制劑及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710304710.3
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101469322A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉麗芝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/50;A61P1/16
• 代理公司: 北京市德權(quán)律師事務(wù)所
• 代理人: 吳 濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞制劑及其制備方法，具體地，這種細(xì)胞制劑中的 細(xì)胞來自臍帶、胎盤組織的干細(xì)胞，移植入人體后可以用于治療肝組織損 傷性的疾病。

背景技術(shù)

肝纖維化是許多肝臟疾病的共同病理變化，晚期肝纖微化可以進(jìn)展為 肝硬化、門脈高壓、肝功能衰竭，最終需要進(jìn)行肝移植。目前的治療手段 主要包括支持治療、對證治療和抗纖維化治療，然而目前的抗纖維化治療 的缺點(diǎn)是抗纖維化藥物對激活的肝臟衛(wèi)星細(xì)胞引起的纖維化無效，會(huì)產(chǎn)生 多種副作用。可是最近研究表明即使是晚期肝纖維化也是可以逆轉(zhuǎn)的，這 已經(jīng)引起許多研究者的興趣。

近年來，關(guān)于干細(xì)胞制劑的研究不斷深入，干細(xì)胞制劑對某些疾病的 獨(dú)特療效逐步受到重視。干細(xì)胞是人體各種組織器官的起源細(xì)胞，具有自 我復(fù)制和多向分化的特征。目前研究表明骨髓來源的干細(xì)胞可以跨胚層分 化為多種細(xì)胞類型包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞。干 細(xì)胞移植治療對許多慢性疾病和退化性疾病有很好的治療前景，可以分化 為多種組織細(xì)胞從而重建損傷組織和器官。由于從人臍帶中分離純化的組 織干細(xì)胞，具有增殖能力強(qiáng)、來源豐富、采集方便等優(yōu)點(diǎn)，引起研究者的 很大重視。目前已經(jīng)有報(bào)道人臍帶組織干細(xì)胞移植治療心臟病，血液血管 疾病有一定療效。盡管有學(xué)者證明臍帶組織干細(xì)胞能夠減輕肝纖維化，但 是尚無應(yīng)用來源于臍帶細(xì)胞移植促進(jìn)肝細(xì)胞再生同時(shí)修復(fù)肝臟微血管治 療肝損傷性疾病和改善肝功能的先例。因此，開發(fā)用于治療肝組織損傷的 細(xì)胞制劑及其制備方法具有特別重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種新型的用 于治療肝臟損傷和肝硬化等疾病的細(xì)胞制劑及其制備方法，能夠克服上述 肝損傷、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病治療方法的缺點(diǎn)，以及目前已有的 治療肝纖維化干細(xì)胞制劑的局限性，移植進(jìn)體內(nèi)后可參與肝細(xì)胞的再生和 微血管的修復(fù)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種用于肝臟損 傷和肝硬化的細(xì)胞制劑，所述的細(xì)胞制劑包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞和PBS溶液。

所述肝細(xì)胞樣細(xì)胞是由胎盤、臍帶來源的組織干細(xì)胞制劑經(jīng)體外誘導(dǎo) 培養(yǎng)而成。

所述胎盤、臍帶來源的組織干細(xì)胞制劑是由從胎盤、臍帶分離得到的 組織制成的細(xì)胞制劑。

所述組織干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，該細(xì)胞群表達(dá)(陽性率≥ 50％)OCT3/4，SSEA-4，CD13，CD73、CD105，不表達(dá)或低表達(dá)(陽性率 ≤2％)CD34，CD45，CD117，CD133，CD31，vWF，F(xiàn)LK-1以及HLA-DR。

所述肝細(xì)胞樣細(xì)胞的濃度為每毫升0.5-2×10⁷個(gè)細(xì)胞。

一種用于肝臟損傷和肝硬化的細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)從胎盤和臍帶中將組織干細(xì)胞分離純化、培養(yǎng)，制成細(xì)胞懸液， 制成胎盤、臍帶來源的組織干細(xì)胞制劑；

(2)將步驟(1)中的組織干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)，分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞；

(3)將步驟(2)中的肝細(xì)胞樣細(xì)胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成 細(xì)胞制劑。

所述步驟(1)具體包括以下步驟：

第一，將臍帶和胎盤機(jī)械剪切成1mm³小組織塊，采用濃度為1mg/mL 膠原酶I在37℃消化1小時(shí)，再用濃度為0.25％胰酶37℃消化30分鐘， 期間溫和震蕩；

第二，加胎牛血清(FBS)中和胰酶后將組織懸液通過細(xì)胞篩，離心收 集細(xì)胞懸液；

第三，將所得細(xì)胞懸液接種于包被4μg/cm²纖連蛋白的T75cm²培養(yǎng) 瓶中，在添加了10ng/ml表皮生長因子的D/F12+10％胎牛血清(FBS)體系 中培養(yǎng)5到7天；

第四，將得到的呈成纖維樣細(xì)胞的組織干細(xì)胞再消化傳代純化、擴(kuò)增， 濃縮成單個(gè)核細(xì)胞混懸液，得到胎盤、臍帶來源的組織干細(xì)胞制劑。

所述步驟(2)具體包括以下步驟：

第一，取5-10代分離的組織干細(xì)胞，采用D/F12培養(yǎng)體系，血清饑 餓24小時(shí)；

第二，第一階段培養(yǎng)采用IMDM補(bǔ)充20ng/mL肝細(xì)胞生長因子和 10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子，nicotinamide?20ng/L培養(yǎng)體系持續(xù)14 天；