[發明專利]一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑及其制備方法

無效

• 申請號: 200710304710.3
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101469322A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 劉麗芝
• 申請（專利權）人: 北京漢氏聯合生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/50;A61P1/16
• 代理公司: 北京市德權律師事務所
• 代理人: 吳 濤

技術領域

本發明涉及一種細胞制劑及其制備方法，具體地，這種細胞制劑中的 細胞來自臍帶、胎盤組織的干細胞，移植入人體后可以用于治療肝組織損 傷性的疾病。

背景技術

肝纖維化是許多肝臟疾病的共同病理變化，晚期肝纖微化可以進展為 肝硬化、門脈高壓、肝功能衰竭，最終需要進行肝移植。目前的治療手段 主要包括支持治療、對證治療和抗纖維化治療，然而目前的抗纖維化治療 的缺點是抗纖維化藥物對激活的肝臟衛星細胞引起的纖維化無效，會產生 多種副作用。可是最近研究表明即使是晚期肝纖維化也是可以逆轉的，這 已經引起許多研究者的興趣。

近年來，關于干細胞制劑的研究不斷深入，干細胞制劑對某些疾病的 獨特療效逐步受到重視。干細胞是人體各種組織器官的起源細胞，具有自 我復制和多向分化的特征。目前研究表明骨髓來源的干細胞可以跨胚層分 化為多種細胞類型包括肝細胞、膽管細胞、血管內皮細胞和心肌細胞。干 細胞移植治療對許多慢性疾病和退化性疾病有很好的治療前景，可以分化 為多種組織細胞從而重建損傷組織和器官。由于從人臍帶中分離純化的組 織干細胞，具有增殖能力強、來源豐富、采集方便等優點，引起研究者的 很大重視。目前已經有報道人臍帶組織干細胞移植治療心臟病，血液血管 疾病有一定療效。盡管有學者證明臍帶組織干細胞能夠減輕肝纖維化，但 是尚無應用來源于臍帶細胞移植促進肝細胞再生同時修復肝臟微血管治 療肝損傷性疾病和改善肝功能的先例。因此，開發用于治療肝組織損傷的 細胞制劑及其制備方法具有特別重要的臨床意義。

發明內容

為了克服上述現有技術中的不足，本發明的目的是提供一種新型的用 于治療肝臟損傷和肝硬化等疾病的細胞制劑及其制備方法，能夠克服上述 肝損傷、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病治療方法的缺點，以及目前已有的 治療肝纖維化干細胞制劑的局限性，移植進體內后可參與肝細胞的再生和 微血管的修復。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案是提供一種用于肝臟損 傷和肝硬化的細胞制劑，所述的細胞制劑包含肝細胞樣細胞和PBS溶液。

所述肝細胞樣細胞是由胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑經體外誘導 培養而成。

所述胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑是由從胎盤、臍帶分離得到的 組織制成的細胞制劑。

所述組織干細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，該細胞群表達(陽性率≥ 50％)OCT3/4，SSEA-4，CD13，CD73、CD105，不表達或低表達(陽性率 ≤2％)CD34，CD45，CD117，CD133，CD31，vWF，FLK-1以及HLA-DR。

所述肝細胞樣細胞的濃度為每毫升0.5-2×10⁷個細胞。

一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)從胎盤和臍帶中將組織干細胞分離純化、培養，制成細胞懸液， 制成胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑；

(2)將步驟(1)中的組織干細胞在體外誘導，分化成肝細胞樣細胞；

(3)將步驟(2)中的肝細胞樣細胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成 細胞制劑。

所述步驟(1)具體包括以下步驟：

第一，將臍帶和胎盤機械剪切成1mm³小組織塊，采用濃度為1mg/mL 膠原酶I在37℃消化1小時，再用濃度為0.25％胰酶37℃消化30分鐘， 期間溫和震蕩；

第二，加胎牛血清(FBS)中和胰酶后將組織懸液通過細胞篩，離心收 集細胞懸液；

第三，將所得細胞懸液接種于包被4μg/cm²纖連蛋白的T75cm²培養 瓶中，在添加了10ng/ml表皮生長因子的D/F12+10％胎牛血清(FBS)體系 中培養5到7天；

第四，將得到的呈成纖維樣細胞的組織干細胞再消化傳代純化、擴增， 濃縮成單個核細胞混懸液，得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑。

所述步驟(2)具體包括以下步驟：

第一，取5-10代分離的組織干細胞，采用D/F12培養體系，血清饑 餓24小時；

第二，第一階段培養采用IMDM補充20ng/mL肝細胞生長因子和 10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，nicotinamide?20ng/L培養體系持續14 天；