[發明專利]一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑及其制備方法

無效

• 申請號: 200710304710.3
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101469322A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 劉麗芝
• 申請（專利權）人: 北京漢氏聯合生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/50;A61P1/16
• 代理公司: 北京市德權律師事務所
• 代理人: 吳 濤

1.一種用于治療肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑，所述的細胞制劑包含 肝細胞樣細胞和PBS溶液，所述肝細胞樣細胞是由胎盤、臍帶來源的組織 干細胞制劑經體外誘導培養而成，所述胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑 是由從胎盤、臍帶分離得到的組織干細胞制成的細胞制劑，其特征在于， 所述細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，該細胞群表達陽性率≥50％OCT3/4， SSEA-4，CD13，CD73、CD105，不表達或低表達陽性率≤2％CD34，CD45， CD117，CD133，CD31，vWF，FLK-1以及HLA-DR，所述細胞制劑的肝細胞 樣細胞濃度為每毫升0.5-2×10⁷個細胞。

2.權利要求1所述的一種用于治療肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑的制 備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從胎盤和臍帶中將組織干細胞分離純化、培養，制成細胞懸液， 得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞；

(2)將步驟(1)中的組織干細胞在體外誘導，分化成肝細胞樣細胞；

(3)將步驟(2)中的肝細胞樣細胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成 細胞制劑；

所述步驟(1)具體包括以下步驟：

第一，將臍帶和胎盤機械剪切成1mm³小組織塊，采用濃度為1mg/mL 膠原酶I在37℃消化1小時，再用濃度為0.25％胰酶37℃消化30分鐘，期 間溫和震蕩；

第二，加胎牛血清中和胰酶后將組織懸液通過細胞篩，離心收集細胞 懸液；

第三，將所得細胞懸液接種于包被4μg/cm²纖連蛋白的T75cm²培養瓶 中，在添加了10ng/mL表皮生長因子的D/F12+10％胎牛血清體系中培養5 到7天；

第四，將得到的呈成纖維樣細胞的組織干細胞再消化傳代純化、擴增， 濃縮成單個核細胞混懸液，得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞；

所述步驟(2)具體包括以下步驟：

第一，取5-10代分離的組織干細胞，采用D/F12培養體系，血清饑餓 24小時；

第二，第一階段培養采用IMDM補充20ng/mL肝細胞生長因子和 10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，nicotinamide?20ng/L培養體系持續14 天；

第三，第二階段處理IMDM加入20ng/mL?oncostatin?M，1μmol/L? dexamethasone，and?50mg/mL?ITS+premix培養體系持續14天，每周換液兩 次。