[發(fā)明專利]一種腸道病毒的免疫熒光層析檢測試紙及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710304419.6
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101187665A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊奇;周榮;王長兵;王海
• 申請（專利權(quán)）人: 北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/52
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 劉長威

1.一種腸道病毒免疫熒光層析快速檢測試紙，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其特征在于所述標(biāo)記抗體墊包埋有一種或多種腸道病毒的熒光標(biāo)記單克隆抗體；所述反應(yīng)膜上具有一條或多條檢測帶和一條質(zhì)控帶，每條檢測帶上固定有一種腸道病毒的單克隆抗體，檢測帶的條數(shù)以及固定的腸道病毒單克隆抗體與標(biāo)記抗體墊包埋的標(biāo)記抗體相適應(yīng)，質(zhì)控帶固定有能與熒光標(biāo)記單克隆抗體特異結(jié)合的抗抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于，所述的腸道病毒單克隆抗體為輪狀病毒單克隆抗體、腸道腺病單克隆抗體、星狀病毒單克隆抗體或諾瓦克病毒單克隆抗體中的一種或多種。

3.如權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于，所述的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。

4.如權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。

5.如權(quán)力要求1所述，其特征在于，所述熒光標(biāo)記單克隆抗體的標(biāo)記熒光素為Molecular?Probes公司的Alexa?Fluor系列熒光素或安瑪西亞公司的花青素Cy系列熒光素。

6.如權(quán)利要求2～5任一項所述的檢測試紙，其特征在于，制備輪狀病毒單克隆抗體的免疫原為輪狀病毒VP6蛋白；制備腸道腺病毒單克隆抗體的免疫原為腺病毒40/41型六鄰體蛋白；制備星狀病毒單克隆抗體的免疫原為I型星狀病毒CP蛋白；制備諾瓦克病毒單克隆抗體的免疫原為諾瓦克病毒VP1蛋白。

7.一種制備權(quán)利要求1～6任一項所述試紙的方法，其包括如下步驟：

1)在反應(yīng)膜的不同位置上按照抗體的種類分別固定腸道病毒單克隆抗體以及抗抗體，形成檢測帶和質(zhì)控帶；

2)制備標(biāo)記抗體；

3)組裝底板、樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、反應(yīng)膜和吸水墊，并在標(biāo)記抗體墊中包埋標(biāo)記抗體。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，標(biāo)記單克隆抗體的制備方法是：將純化的腸道病毒單克隆抗體用0.1M碳酸氫鈉溶液4℃透析過夜，抗體濃度控制在5-20mg/ml；熒光素用二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶解，濃度為10mg/ml；將溶解后的熒光素加入透析后的單克隆抗體，在室溫條件下磁力攪拌1小時，熒光素與單克隆抗體的質(zhì)量比為1∶10～20；反應(yīng)后用1.5M羥胺氯化物終止反應(yīng)，抗體熒光素標(biāo)記過程完成；用Sephadex?G25凝膠柱將抗體熒光素標(biāo)記物進(jìn)行純化，得到純度高的單克隆抗體熒光素標(biāo)記物。

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，標(biāo)記單克隆抗體的制備方法是：將熒光微球用50mM?pH6.0MES緩沖液透析，濃度調(diào)整到10mg/ml，體積20ml；配制9.38％的碳二亞胺的MES緩沖液和10％的NHS的MES緩沖液；20ml微粒加入NHS溶液7.2ml，EDAC溶液1.6ml，用MES緩沖液補(bǔ)充體積到40ml，37℃不斷旋轉(zhuǎn)反應(yīng)1個小時；取上述活化熒光微粒20mg，用50mM?pH?8.0磷酸緩沖液離心洗滌，并且濃縮成1ml；加入腸道病毒單克隆抗體4mg，并補(bǔ)充體積到2ml，使最終反應(yīng)濃度為：熒光微球10mg/ml、抗體2mg/ml，37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)4個小時；停止反應(yīng)，將反應(yīng)后熒光微球12000rpm?4℃離心30分鐘，棄去上清，沉淀物用50mg/ml牛血清白蛋白稀釋，超聲波處理。