[發明專利]H5亞型禽流感病毒環介導等溫擴增檢測的試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 200710302588.6
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101215610A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 焦新安;潘志明;耿士忠;張磊;陳祥;孫林;黃金林;殷月蘭
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所
• 代理人: 江平

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及H5亞型禽流感病毒的檢測技術領域。

背景技術

高致病性禽流感(Highly?Pathogenic?Avian?Influenza，簡稱HPAI)，曾稱真性雞瘟，是由正粘病毒科A型流感病毒特定亞型引起的一種急性、烈性傳染病，嚴重危害養禽業和人類健康。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定通報傳染病，我國將其定為一類動物傳染病。2003年底至今，全球人感染H5N1亞型禽流感病例336例，其中死亡病例207例。

在HPAI疫情防控工作中，現場診斷主要依靠發病史、臨床癥狀、病理變化和流行病學調查綜合判定，這給廣大獸醫工作人員帶來了超負荷的工作，耗時費力費錢。現場診斷工作中急需快速準確的篩檢診斷方法，以利于現場疫情的確認。因此，禽流感疫情現場快速確認，對于采取果斷有效的撲滅和防控措施十分關鍵。另一方面，在實驗室確診工作中，OIE規定的經典方法是病毒的分離、鑒定和血清學分型試驗，這種方法報告結果時間長，工作量大。而目前普遍采用的聚合酶鏈反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程繁瑣的缺點。熒光實時定量聚合酶鏈反應(real?time?PCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但需要更復雜的定量測定儀器，因此不適于現場快速檢測，同時由于檢測成本較高，也加大了推廣應用的難度。環介導等溫擴增(Loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)技術具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優點，其特點是對靶基因的6個部位設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結果比PCR更特異，另外，由于實行的是等溫擴增，反應在恒溫水浴箱內便可完成，不僅節約儀器成本，而且操作方法更簡單，適于現場快速檢測。但目前還未見有專門用于H5亞型禽流感病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法的報道。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術中檢測H5亞型禽流感病毒所需周期長、靈敏度較低、成本高、現場應用困難等問題，提供H5亞型禽流感病毒的檢測試劑盒。

本發明由反應液A和反應液B組成：

(1)反應液A：

含有10倍等溫反應緩沖液、濃度為8U/μl的禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶、濃度為40U/μl的核酸酶抑制劑、濃度為8U/μl的Bst?DNA聚合酶、濃度為10mM的dNTP、濃度為100mM的硫酸鎂、濃度為20μM的內引物1、濃度為20μM的內引物2、濃度為10μM的外引物1、濃度為10μM的外引物2和濃度為5M的甜菜堿。

其中：

10倍等溫反應緩沖液含有濃度為200mM、pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、濃度為100mM的氯化鉀、濃度為100mM的硫酸銨、濃度為20mM的硫酸鎂和濃度為1％的曲拉通X-100。

內引物1為：TCTTTGTCTGCAGCGTAYCCTTTTGGGAATGGTAGATGGTTGG

內引物2為：ATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTTTTTCTAAGTTTTTAAATTCCCTTCCAAC

外引物1為：TATAGAGGGRGGATGGCA

外引物2為：CCGTCTTCCATYTTYTTGTT

(2)反應液B：1000倍熒光染料SYBR?Green?I。

其中，反應液A最佳組成是：2.5μl?10倍等溫反應緩沖液、1.0μl?AMV反轉錄酶(8U/μl)、0.25μl核酸酶抑制劑(40U/μl)、1.0μl?Bst?DNA聚合酶(8U/μl)、1.5μl10mM?dNTP、1.5μl?100mM硫酸鎂、2.0μl?20μM內引物1、2.0μl?20μM內引物2、0.5μl10μM外引物1、0.5μl?10μM外引物2、5.0μl?5M甜菜堿和5.25μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，反應液A總體積量為23μl。