[發明專利]一種白腐真菌及其選育方法和應用

無效

• 申請號: 200710300037.6
• 申請日: 2007-12-24
• 公開（公告）號: CN101469312A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 常東民;李市場;吳慧霞;茹群朵;左雪梅;王耀民;王娜;郭至瑞
• 申請（專利權）人: 河南仰韶生化工程有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;C12N13/00;C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 陳 浩

1、一種白腐真菌(Trametes?Versicolor)YS-L613，其特征在于：其由以下方法誘變選育而制得，以白腐真菌為出發菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結合的復合誘變育種技術，選育出漆酶高產菌株YS-L613。

2、一種如權利要求1所述的白腐真菌(Trametes?Versicolor)YS-L613的誘變選育方法，其特征在于：以白腐真菌為出發菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結合的復合誘變育種技術，選育出漆酶高產菌株YS-L613。

3、根據權利要求2所述的白腐真菌(Trametes?Versicolor)YS-L613的誘變選育方法，其特征在于：具體方法包括以下步驟：

(1)出發菌種，以白腐真菌YS菌株為出發菌種，4℃保藏于CPDA斜面；

(2)培養基①斜面培養基(CPDA)為每20％土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgSO₄·7H₂O?1—2g、KH₂PO₄?2—4g、VB1?1—3mg、瓊脂粉13—16g；②搖瓶液體發酵培養基：每1000mL發酵培養基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgSO₄·7H₂O?0.1—1g、FeSO₄·7H₂O?8—12mg、MnSO₄·4H₂O?0.1—1mg、ZnSO₄·7H₂O?0.1—1mg、CuSO₄·5H₂O?1—3mg、NaHPO₄·H₂O?90—110mg、KH₂PO₄?0.1—1g、CaCl₂?8—12mg、VB1?48—52mg、Kraft　Lignin(堿溶木素)0.1—1g；③液體種子培養基：葡萄糖1—3％、MgSO₄·7H₂O?0.1—1％、KH₂PO₄?0.1—0.5％、VB1?2×10^-4％、土豆汁20％、其余為水；發酵培養基(g/L)：玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgSO₄·7H₂O?0.1—1g、FeSO₄·7H₂O?8—12mg、MnSO₄·4H₂O?0.5—1mg、ZnSO₄·7H₂O?0.5—1mg、CuSO₄·5H₂O?1—3mg、NaHPO₄·H₂O?90—110mg、KH₂PO₄?0.5—1g、CaCl₂?8—12mg、VB1?50mg、KraftLignin(堿溶木素)0.5—1g，pH8.5；

(3)種瓶制備：取保藏的真菌斜面進行活化培養，挑取適量菌絲塊于250mL的三角瓶中(內裝50mL液體培養基)，于30℃，150r/min，振蕩培養3d；發酵培養：將種瓶培養物勻漿后接入發酵瓶，于30℃，150r/min，培養5天；

(4)菌懸液的制備：將培養4—5d斜面菌種，有無菌的生理鹽水洗下菌絲體，經玻璃珠打散，制成含菌體10⁶-10⁸的懸液；①紫外線誘變：取10ml菌懸浮液于直徑為9cm的平皿中，磁力攪拌，于20W紫外線燈15—20cm處，照射1—10min；②亞硝基胍(NTG)誘變：用pH　6.0、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成的菌懸液于同樣的磷酸鹽緩沖液的NTG液等量混合，分別以0.25、0.5、1.0mg/ml?NTG濃度，30℃溫度，誘變20min，稀釋法終止反應；③⁶⁰Co　γ-射線輻射誘變：取10ml菌懸浮液于無菌試管中，分別以8萬、10萬、倫琴進行60Coγ-射線輻射；④離子束注入誘變處理：取純種斜面加入10mL無菌水洗脫菌絲體，并稀釋成一定濃度的菌絲體懸液，取0.1mL菌懸液于無菌空平皿中涂均勻，用無菌風吹干；然后放入離子注入機的靶室進行離子注入，注入完畢后，用無菌水洗脫，稀釋涂平皿，等單單菌落生成后，轉接于斜面培養基上；⑤微波誘變：吸取制得菌懸浮液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的菌液為10ml，調整微波爐(格蘭仕)功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，輻照處理20s、40s、60s、80s、100s，其中每輻照10s，要冷卻10s，然后適當稀釋涂分離平板；

(5)突變株分離：上述各誘變處理的菌懸液，取0.1ml涂布與分離培養基上30℃，培養4—5天(紫外線誘變平板避光培養)，挑取單菌落，培養3—4天備用；

(6)篩選，對誘變入后的菌株進行篩選時，突變株酶活力高于對照菌株5％的突變株為正突變，而低于5％的菌株稱為負突變，在±5％之間作為未突變菌株。