[發明專利]一種基因免疫制備人類Ⅰ型胸苷激酶單克隆抗體的新方法

無效

• 申請號: 200710203299.0
• 申請日: 2007-12-21
• 公開（公告）號: CN101186922A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發明（設計）人: 丁克祥;鄭永晨;劉衛國;費定宇;丁宇
• 申請（專利權）人: 丁克祥
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/79;C12N5/18;C07K16/40;G01N33/577
• 代理公司: 岳陽市科明專利事務所
• 代理人: 彭乃恩

技術領域

本發明涉及一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆抗體的方法，既是采用基因工程和分子免疫學技術，通過對人類I型胸苷激酶基因的克隆和真核分泌型載體的重組構建所實施的一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆抗體的新方法。該方法所制備的單克隆抗體應屬于基因工程類產品。

背景技術

關于人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶I型(hTK1)的技術背景：hTK1，其中文名稱是人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶I型，而中文簡稱則是人胸苷激酶I型；它的英文名稱是Human?thymidinekinase，而英文簡稱則是hTK1；它的酶學中文命名是三磷酸腺苷或腺苷三磷酸：胸苷5-磷酸轉移酶，EC.2.7.1.21，激酶，而它的酶學英文命名則為ATP：thymidine5-phosphotransferase，EC.2.7.1.21。早在上個世紀就有學者指出，DNA在合成之前，胸腺嘧啶脫氧核苷(TdR)被攝入細胞并在轉化成TMP時必須經過磷酸化激酶的催化。事實上，通過從真核和原核生物分離和部分純化所得到的TK的酶學實驗中也確認了磷酸化反應過程必須有TK酶的催化。人細胞中的hTK主要以兩種同工酶的形式存在，即hTK1和hTK2。hTK1主要存在于細胞質中，而hTK2則主要存在于亞細胞結構的線粒體中。由于其中一種同工酶大量存在于胚胎組織，也有學者分別稱它們為胚胎TK(Fetal?TK)和成人TK(Adult?TK)。有研究發現，胚胎TK是與細胞的分裂相關，存在于細胞質中，稱之為hTK1；而成人TK存在于線粒體中，它的表達與細胞周期無關，又稱之為hTK2。或者將hTK1稱為細胞質胸苷激酶，hTK2稱為線粒體胸苷激酶。通常，hTK1基因定位在于染色體17q23.2-q25.3，靠近于半乳糖激酶；而hTK2基因則定位于染色體16q22-q23.1。關于hTK1的結構，在上個世紀80年代就有學者完成了人TK1基因編碼區域的cDNA分子克隆，并且完成了其序列分析。研究表明，從人宮頸癌(HeLa)提取hTK1，其單體的轉錄編碼為分子量2.4萬并具高度保守區域的核苷激酶，hTK1全酶是分子量為96000道爾頓的四聚體，等電點聚焦免疫電泳測得其等電點為8.3-8.5。hTK1的四聚體中每一單體α螺旋/β折疊區域組成與ATP酶家系類似，有一p-環是hTK1酶活性調節區域，即底物反應區域。四聚體中β折疊區域有一鋅原子與β折疊區域連接。在這β-絲狀帶折疊的底部，干鏈變寬成為一個套索閉環，是dTTP負責TK1活性反饋抑制調節的的區域，但TK1這套索環結構是不同于其它脫氧核苷酸激酶。hTK1是存在于機體中的重要激酶之一，其主要生理和生化作用是它作為一種胸腺嘧啶脫氧核苷代謝及補救途徑的激酶，在三磷酸腺苷或腺苷三磷酸(ATP)作為供體和二價鎂離子(Mg²⁺)參與的條件下，迅速催化脫氧胸苷(thymidine，Thd)轉變為一腺胸苷酸(TMP)。因此，hTK1是與細胞增殖、分化和細胞周期密切相關的激酶，也被認為是機體合成DNA的關鍵酶之一。然而，hTK1酶并不是機體必需的一種激酶提供體內細胞DNA合成所需要的前體物dTMP，但與體內合成途徑比較，TK1酶合成dTMP是直接采用細胞中核甘酸再循環方式，在增殖細胞和腫瘤細胞中，具有活性催化的功能的四聚體細胞質胸苷激酶(TK1)。正如前敘，TK1的催化反應過程是在ATP作為供體和二價鎂離子(Mg²⁺)參與的條件下，催化脫氧胸苷(Thd)生成一腺胸苷酸(TMP)，這種磷酸化方式是唯一的通途引入Thd到DNA合成代謝中，又被稱之為一種嘧啶補救合成的DNA的關鍵酶和S-期特殊酶。hTK作為一種激酶是胸苷參與DNA合成的關鍵酶，它能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的轉化，它能真實而客觀地反映著細胞的增殖狀況，而其中與細胞增殖關系最為密切相關的是hTK1。正是由于hTK1與細胞分裂密切相關，在細胞分裂G1期含量較低，到S期后逐漸升高，至G2期達到最高，因此，編碼hTK1的mRNA及其所表達的蛋白質也就成為細胞增生的標志物。可以說，TK1水平的高低與DNA在細胞周期的S期DNA合成速度密切相關。一般情況下，所觀察到正常增殖細胞TK1的水平在細胞周期的G1和S期交界處開始升高，隨著細胞進入G1晚期，TK1酶的水平逐漸急劇上升，直至S和G2期交界處，但在腫瘤細胞中，這種高TK1水平從S晚期一直持續到M早期。大量離體試驗結果表明，TK1在增殖細胞和腫瘤細胞周期調控代謝過程具有特殊的意義。通常，一些非增殖細胞的TK1和健康人血清和組織中TK1，其含量極微或檢測不到，而在異常增殖細胞或惡性腫瘤患者中，TK1酶伴隨著腫瘤細胞數的急劇增殖而升高。不同來組織增殖細胞中細胞周期與TK1信使RNA(TK1mRNA)的表達關系是復雜的，mRNA的剪切和翻譯也是隨細胞生長狀態變化的，推測TK1水平主要是通過翻譯后調控機制發揮作用。而且，已有研究表明，增殖細胞生長的不同時期，TK1活性的調控則主要是通過dTTP反饋抑制途徑和底物循環方式進行調節的。正是由于TK1與細胞異常增殖和腫瘤細胞表達密切相關，即在非增殖細胞和健康人血清中，含量極微或檢測不到，而在惡性腫瘤患者中伴隨著腫瘤細胞的急劇增殖而升高等特征，使學術界對TK1的研究引起了廣泛的關注和重視，并認為TK1有可能作為一種有價值的血清學細胞增殖標記物來檢測增殖細胞的增殖活性，適用于惡性腫瘤的細胞增殖度檢測。特別是已有文獻表明，TK1的活性在腫瘤細胞大于總量的95％，而TK2低于5％，在正常健康人的血清中檢測很低或不可以檢測，因此采用檢測血清TK活性將評估腫瘤增殖的惡性程度。hTK1在細胞異常增生時含量或活性增高，特別是在細胞增生旺盛的早期惡性腫瘤患者的體液或血液中更是顯著增高，且hTK1水平的高低與惡性腫瘤的切除和復發呈降低和升高的趨勢。曾有學者曾采用12種人癌組織進行免疫組化分析，發現TK1均呈現陽性結果，這初步證明了癌癥患者與TK1活力或含量增高有關，且進一步試驗也證明，隨著腫瘤細胞增殖速度明顯提高，TK1活力增強，DNA合成速度加快，從而促進了腫瘤細胞的進一步增殖，形成一個病情不斷加重的惡性循環。關于TK1的穩定性，大多數報道認為TK1的穩定性欠佳，而且在組織或細胞萃取液中的TK1的穩定性也較差，即使是在4℃環境條件下也不穩定，這可能與TK1四聚體結構降解有關。如保存在20℃以下，TK1活性可以穩定1-3星期。純化的TK1或重組人TK1則需要保存在-80℃冷藏環境。當然，TK1在血清中保存是穩定的，通常在20℃條件下可保存5年以上，其之所以穩定的可能原因，被認為是TK1在血清中是與其它蛋白質形成一大分子穩定的復合物有關。不過，關于血清TK1的結構和性質仍然是不清楚的，其中包括這酶在細胞內被破壞或者是由細胞以活性或非活性的狀態被分泌出去。為了進一步研究及臨床診斷和治療的需要，有學者設法從相關癌組織或癌細胞對TK1進行提取分離制備。但采用生物化學的方式進行提取制備不僅十分繁瑣且得不償失。為此國內外學者(包括我們自己的研究團隊)采用基因工程的方法制備TK1和TK1單克隆抗體的制備。