[發明專利]一種用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型

無效

• 申請號: 200710203168.2
• 申請日: 2007-12-18
• 公開（公告）號: CN101200707A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 陳祥貴;楊瀟;戴清源
• 申請（專利權）人: 西華大學
• 主分類號: C12N5/16
• 分類號: C12N5/16;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所
• 代理人: 馬昌軍

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種能夠篩選抗糖尿病藥物的細胞模型。

背景技術

藥物篩選模型是用于證明某種物質具有藥理活性(生物活性、治療作用)的實驗方法，是尋找和發現新藥物的重要條件之一。分子與細胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少，藥物作用機制明確，可實現高通量篩選等特點，已經成為目前藥物篩選的主要方法。

糖尿病是一種以“三多一少”為典型特征的全身代謝紊亂性疾病。據估計，目前全世界糖尿病患者已達1.3億人，對于抗糖尿病藥物的需求十分迫切。而目前用于治療II型糖尿病的藥物均存在一定的副作用，因此目前急需更安全有效的藥物和治療方法。

胰島素信號轉導通路與II型糖尿病有著密切的聯系。胰島素先與細胞膜上的胰島素受體(IR)相結合。IR是一個跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。胰島素與IR結合后，激活其酪氨酸激酶活性，并將胰島素受體底物(IRS)磷酸化而激活從而引起細胞內的一系列生理反應。目前已經鑒定了IR的多種底物分子。信號轉導和轉錄激活物5b(signal?transducer?andactivator?of?transcription?5b，STAT5b)是最新被鑒定的IRS。STAT5b通過其SH2序列與IRβ亞基的960位酪氨酸相互作用，能被純化的胰島素受體酪氨酸激酶活性結構域磷酸化。胰島素能刺激IR高表達的細胞內源性STAT5b的酪氨酸磷酸化(Sawka-Verhelle，D.，Filloux，C.，et?al..Identification?of?STAT5B?as?asubstrate?of?the?insulinreceptor.Eur.[J]Biochem，1997，250：411～417)。另外，與其他已經發現的IRS不同，STAT5b是一轉錄激活因子，經胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)激活的STAT5b與核內具有STAT5響應元件的靶基因調控序列結合，從而激活靶基因的轉錄和表達(Stoecklin，E.，Wissler，M.，，et?al.Specific?DNA?binding?of?Stat5，but?not?of?glucocorticoidreceptor?is?required?for?their?functional?cooperation?in?the?regulation?of?genetranscription.[J]Mol.Cell.Biol.1997，17：6708～6716)。

胰島素是IR的天然激動劑。目前，所有I型糖尿病患者和口服糖尿病藥物不能控制血糖水平的II型糖尿病患者需要采用胰島素治療。但是，由于胰島素是一個多肽分子，口服會被消化而喪失活性，而依賴注射進行治療，給患者帶來很大的不便和痛苦。而且，長期使用胰島素可能導致體重增加，嚴重的胰島素抵抗等副作用。因此，尋找可以口服的非肽小分子胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)激動劑備受關注，但是一直沒有取得突破。

已有文獻報道中篩選IRTK激動劑的方法大多采用免疫化學檢測IR的磷酸水平，或部分分離IR體外檢測其激酶活性。這些方法費用較高，操作煩瑣、難以實現高通量篩選，本領域急需建立新的篩選方式。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能高通量篩選抗糖尿病藥物的細胞模型。

解決本發明技術問題的技術方案為：一種篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，是克隆了IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、以及由STAT5B應答元件調控的報告基因的編碼序列的哺乳動物細胞。

其中，上述細胞模型中的IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列和由STAT5B應答元件調控的的編碼序列均能穩定表達。

其中，上述細胞模型中的哺乳動物細胞為HepG2、293T、3T3-L1或CHO中的任一種。

其中，上述細胞模型中的STAT5B應答元件的序列為5’-TGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTTTG-3’。

進一步的，上述細胞模型中的報告基因由2-10個STAT5B應答元件串連或重復組成的DNA調控序列調控。

其中，上述細胞模型中報告基因為LUC基因、CAT基因或GFP基因中的任一種。

本發明還提供了一種制備上述篩選抗糖尿病藥物的細胞模型的方法，該方法包括以下步驟：

將哺乳動物細胞培養至對數生長期后，將分別裝載有IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、2～10個串聯的STAT5B應答元件DNA序列調控的報告基因編碼序列的表達載體共轉染哺乳動物細胞，經穩定篩選后得到本細胞模型。