[發明專利]家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產品和應用

無效

• 申請號: 200710200375.2
• 申請日: 2007-04-02
• 公開（公告）號: CN101054408A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 吳建偉;國果;宋智魁;付萍;秦容貴;張勇
• 申請（專利權）人: 貴陽醫學院
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P37/00;A23K1/16;A23L3/3463
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所
• 代理人: 郭防

1.一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于：將抗菌肽粗提液進行透析，透析內液經固相萃取，洗脫組分經超濾分離，活性組分進一步用反相高效液相色譜純化出兩個抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽；具體的分離步驟如下：（1）透析：將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過夜，其間換掉外液兩次；取內液用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，-20℃保存備用；（2）固相萃取：取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak?C₁₈Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇和三氟乙酸后，超純水溶解，檢測該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存備用；（3）超濾：將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續將未透過超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質分為三個部分：分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測蛋白濃度和抗菌活性；（4）反相高效液相色譜純化：超濾后分子量為3～30KD的活性組分用0.22μm微孔濾膜過濾,?100μl上C₁₈反相色譜柱，流動相A：0.1％三氟乙酸-水溶液；B：0.1％三氟乙酸-甲醇溶液；色譜柱用5%甲醇-0.1%三氟乙酸溶液平衡，洗脫條件為：梯度洗脫，30min內已腈濃度從5％上升到60％；流速1ml/min，手工收集214nm波長洗脫峰，即獲得兩個抗菌肽組分。

2.按照權利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于：所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲外分泌物粗提液的制備為：取三齡家蠅幼蟲置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時，不時振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮,?即得抗菌肽粗提液，4℃保存備用。

3.按照權利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于：所用的Sep-pak?C₁₈Cartridge固相萃取小柱在加樣前預用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸－水平衡；所用的C₁₈反相色譜柱為Beckman,System?Gold,U.S.A.,ODS?0.5μm,0.46×25cm。

4.如權利要求1-3中任一項所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。

5.如權利要求4所述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細菌感染的藥物或保健品中的應用。

6.如權利要求4所述家蠅分泌型抗菌肽在動物飼料或防腐劑中的應用。