[發明專利]家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產品和應用

無效

• 申請號: 200710200375.2
• 申請日: 2007-04-02
• 公開（公告）號: CN101054408A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 吳建偉;國果;宋智魁;付萍;秦容貴;張勇
• 申請（專利權）人: 貴陽醫學院
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P37/00;A23K1/16;A23L3/3463
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所
• 代理人: 郭防

技術領域：本發明涉及一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產品和應用，屬于昆蟲抗菌肽的分離純化技術領域。

背景技術：昆蟲每天都會直接接觸、食入、吸入成千上萬的病原微生物而不至于患感染性疾病，這種抵抗外來致病微生物的能力主要是通過天然免疫的防御機制得以實現。抗菌肽是所有物種中天然防御機制的重要組成部分，這類多肽可以是固有表達的，也可以被病原微生物及其產物誘導表達。

昆蟲抗菌肽是一類分子量小、水溶性好、穩定、抗菌譜廣且抗菌機制獨特的多肽，是生物免疫系統產生的一類抵抗外界病原體感染的物質。不少科學家認為，昆蟲具有驚人的天然免疫力，并以抗菌肽作為其宿主防御機制的主要成分。抗菌肽除有非特異性的抗病原微生物外，還有抗腫瘤細胞的作用，而對人體的正常細胞無破壞作用。因此，抗菌肽的開發和利用是目前抗病原微生物藥物開發研究中的一個熱點。

家蠅是重要的醫學昆蟲，能夠機械傳播人、畜多種病原菌如細菌、病毒和寄生蟲卵等。目前國內外報道已從其幼蟲血淋巴中分離到了多種抗細菌、真菌、原蟲的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼蟲體外分泌物中發現了廣譜的抗植物病原菌、植物根結線蟲及寄生蟲卵的物質。但這些研究多集中于抗菌肽的誘導及活性檢測階段，而體外不同環境對其抗菌活性的影響均無報道。目前，抗菌肽的純化方法多使用性質溫和的凝膠層析，但該方法所需時間較長，每次上樣量及目的蛋白的回收量較小。

發明內容：

本發明的目的在于：提供一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產品和應用。本發明采用透析、固相萃取、超濾和反相高效液相色譜方法從家蠅幼蟲分泌物中分離到具廣譜抗菌活性的肽類物質，使抗菌肽制備時間縮短，提高了分離純化的效率，而且該抗菌肽在體外不同的環境中其抗菌活性具有較強的穩定性，可通過破壞細菌細胞膜通透性、抑制細菌體分裂、阻礙與細胞分裂相關的某些蛋白質的合成等途徑發揮抗菌作用；具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對細菌感染有一定的保護作用。

本發明是這樣實現的：家蠅分泌型抗菌肽的分離方法為：將抗菌肽粗提液進行透析，透析內液經固相萃取，洗脫組分經超濾分離，活性組分進一步用反相高效液相色譜純化出兩個抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。

所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲外分泌物粗提液的制備為：取三齡家蠅幼蟲置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時，不時振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存備用。

具體的分離方法為：(1)透析：將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過夜，其間換掉外液兩次；取內液用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，-20℃保存備用；(2)固相萃取：取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak?C₁₈?Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超純水溶解，檢測該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存備用；(3)超濾：將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續將未透過超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質分為三個部分：分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測蛋白濃度和抗菌活性；(4)反相高效液相色譜純化：超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過濾，100μl上C₁₈反相色譜柱，流動相A：0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B：0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色譜柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脫條件為：梯度洗脫，30min內己腈濃度從5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波長洗脫峰，即獲得兩個抗菌肽組分。

以上所用的Sep-pak?C₁₈?Cartridge固相萃取小柱在加樣前預用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C₁₈反相色譜柱為Beckman，System?Gold，U.S.A.，ODS?0.5μm，0.46×25cm。

上述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。

上述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細菌感染的藥物或保健品中的應用。