[發明專利]一種麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法

有效

• 申請號: 200710195003.5
• 申請日: 2007-12-10
• 公開（公告）號: CN101343312A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 沈世華;劉玉君;茍平
• 申請（專利權）人: 云南神宇新能源有限公司
• 主分類號: C07K1/26
• 分類號: C07K1/26;C07K4/10
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司
• 代理人: 宮建華

一、技術領域

本發明涉及一種植物種子油體蛋白質分離方法，更特別的涉及一種麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法。

二、背景技術

隨著石化能源的日趨枯竭和生態環境的日漸惡化，可再生且清潔的生物能源的研究開發已成為近年來的熱點課題，以植物油為主要原料的生物柴油作為一種可再生的替代能源，以其良好的環境效應已引起廣泛關注。植物油主要作為營養貯存物質積累于種子中，因而篩選和種植優質的油料作物作為制備生物柴油的原料，已成為解決能源危機的重要途徑。麻瘋樹(Jatropha?curcas?L.)是大戟科麻瘋樹屬多年生亞喬木。對麻瘋樹種子油脂成分，理化性質，十六烷值等研究表明麻瘋樹種子油是制備生物柴油的理想材料。目前國內內非常重視利用麻瘋樹種子生產生物柴油產業，云南、四川等地已投巨資建成麻瘋樹種植基地。

油分是以油體的形式存在于細胞中。油體外部被一層磷脂和蛋白質鑲嵌而成的半單位膜，脂肪酸以三酰甘油的形式儲存其內。油體膜及膜上附著的蛋白占油體重量的1％-4％，參與油體的結構建成，并在油體的形成、穩定及油脂代謝利用過程中發揮關鍵作用，對油體發揮其生物功能十分關鍵。分離麻瘋樹種子的貯油細胞器-油體及油體蛋白，有利于了解生物柴油的重要植物儲藏庫，為運用生物技術手段進一步改良品種，提高種子的油脂含量打下基礎。

三、發明內容

本發明的目的是提供一種麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法。

本發明的這些以及其它目的將通過在下面的詳細描述來進一步體現和說明。

本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法，采用蛋白質雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行分離，包括第一向等電聚焦電泳步驟、膠條平衡步驟和第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟。

在本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法中，所述的第一向等電聚焦電泳步驟為采用IPG預制膠條(購于Amersham?Biosciences，Uppsala，Sweden)，分為兩段拼接，中酸性端pH4-7，長度9-12cm，中堿性端pH6-11，長度9-12cm，將預制膠條浸泡在180-250微升含有0.5-1.0毫克蛋白質樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳儀為Multiphor?IIelectrophoresis?unit(購于Amersham?Biosciences，Uppsala，Sweden)，電泳條件為20℃恒溫，先分別在300V、600V和1000V電壓下電泳0.6-1.5小時，再在8000V電壓下電泳5-7小時。

進一步的，在本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法中，所述的第一向等電聚焦電泳步驟為采用IPG預制膠條(購于AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)，分為兩段拼接，中酸性端pH4-7，長度11cm，中堿性端pH6-11，長度11cm，將預制膠條浸泡在200微升含有0.5-1.0毫克蛋白質樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳儀為Multiphor?II?electrophoresis?unit(購于Amersham?Biosciences，Uppsala，Sweden)，電泳條件為20℃恒溫，先分別在300V、600V和1000V電壓下電泳1.0小時，再在8000V電壓下電泳6小時。

在本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法中，所述的膠條平衡步驟為等電聚焦完成后，取出膠條，在含1.0％二硫蘇糖醇(DTT)、6.0M尿素、30％w/v甘油、2.5％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)、50mM?Tris-HCl和余量去離子水，pH8.6的平衡緩沖液中平衡15分鐘后，再轉入2.5％碘乙酰胺上述平衡緩沖液中平衡15分鐘。

在本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法中，所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰胺分別為15-20％分離膠和3-6％濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉移到垂直板膠的上端，用1％的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿含0.2-0.5％Tris-HCl、1.00-1.6％甘氨酸、0.05-0.1％SDS的電極緩沖液，在電流為30mA的條件下電泳2.5-4小時。

進一步的，在本發明的麻瘋樹種子油體蛋白質分離方法，所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰胺分別為17％分離膠和4％濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉移到垂直板膠的上端，用1％的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿含0.3％Tris-HCl、1.44％甘氨酸、0.1％SDS的電極緩沖液，在電流為30mA的條件下電泳約3小時。