[發明專利]5’-核苷酸酶診斷試劑盒及5’-核苷酸酶活性濃度測定方法

無效

• 申請號: 200710191493.1
• 申請日: 2007-12-19
• 公開（公告）號: CN101464291A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12Q1/68;C12Q1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種5’-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5’-核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。

背景技術

醫學研究表明，5’-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發膽管炎、原發性和繼發性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5’-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5’-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。

5’-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為：5’-核苷酸酶作用于H³-dUMP，終止反應后，通過離子交換層析柱分析結果，求得5’-核苷酸酶活性?；蛘呃?’-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5’-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發明的方法，準確度不好，強酸污染環境等等，也不適合推廣應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric?Method)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5’-核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的5’-核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5’-核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明5’-核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下：

核苷單磷酸+水??5核苷酸酶??核苷+磷酸根

磷酸根+草酰乙酸??磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

???????????????????二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水

二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶??丙酮酸脫氫酶

?????????????????????????????丙酮酸+輔酶A+輔酶

核苷單磷酸可以是：腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等這種方法應用5’-核苷酸酶(5‘-Nucleotidase；EC?3.1.3.5)酶(偶)聯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate?carboxylase；EC4.1.1.31)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate?dehydrogenase；EC?1.2.1.51)酶促反應連續監測法。5’-核苷酸酶酶解核苷單磷酸反應產生磷酸根，再通過(偶)聯合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5’-核苷酸酶的活性濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明5’-核苷酸酶診斷試劑較為理想：

緩沖液????????????????????????????????100mmol/L

穩定劑????????????????????????????????500mmol/L

還原型輔酶????????????????????????????0.25mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶????????????????10000U/L

丙酮酸脫氫酶??????????????????????????12000U/L

核苷單磷酸????????????????????????????8mmol/L

草酰乙酸??????????????????????????????12mmol/L

乙酰輔酶A?????????????????????????????3mmol/L

本發明的5’-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括：