[發明專利]一種微囊藻毒素分離純化的方法

無效

• 申請號: 200710190610.2
• 申請日: 2007-11-27
• 公開（公告）號: CN101168561A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 虞銳鵬;陶冠軍;秦昉;王中嬋;貢小清
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K7/64
• 分類號: C07K7/64;C07K7/52;C07K1/22;C07K4/08
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種微囊藻毒素分離純化的方法，屬于生化分離技術領域。本發明設計從有毒藍藻中分離純化微囊藻毒素的方法。適用于天然藍藻水華物中去除雜質，分離純化得到三種微囊藻毒素。

背景技術

水體的富營養化已是一個眾所周知的全球性環境問題。近些年我國的滇池、太湖、巢湖等眾多湖泊都發生了藍藻水華污染，其頻繁暴發破壞了湖泊的自然生態平衡，導致水質極度惡化且日趨嚴重。其間不斷產生微囊藻毒素對水體環境和人類健康的潛在危害引起了廣泛的重視。圍繞微囊藻毒素開展的各類研究包括它產生的機制、環境中其濃度的測定、有效的去除措施及毒性效應的全面認識。隨著對微囊藻毒素研究的廣泛開展，科研、教學領域對微囊藻毒素的標準品的需求越來越大，對水體、水產品中微囊藻毒素含量的檢測已經成為人類飲用水水質監控以及食品安全檢測中不可缺少的指標。

微囊藻毒素的標準品主要來源于國外化學試劑公司，因為價格昂貴和其它非科學因素和經濟因素的限制，標準品的獲得成為了限制開展各類相關研究的制約因素。目前國內外從微囊藻中提取純化微囊藻毒素方法大都采用反相硅膠層析填料作為分離介質，用甲醇作為洗脫試劑得到純化品。其不足之處在于，填料價格貴(高于10000元/公斤)，反復使用后效果變差，試劑毒性很大，每次只能得到很少量的微囊藻毒素。

大孔吸附樹脂是一種具有高分子網狀孔穴結構的新型高分子吸附樹脂，同時具有化學吸附和物理篩選兩種分離的性能，吸附容量大，選擇性好且價格低廉(低于100元/公斤)，目前已成功分離了多種肽類化合物，被廣泛地應用于廢水處理、醫藥、食品、生物工程等領域。

用大孔吸附樹脂對微囊藻毒素進行分離純化的方法尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種微囊藻毒素分離純化的方法，大規模、安全、廉價的從有毒藍藻水華物中通過兩步層析法同時分離純化微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR和微囊藻毒素-LR的技術，適用于需求量大但純度要求不高的研究性實驗。本方法操作簡單，溶劑安全性高，設備簡單，成本低。

本發明的技術方案：一種微囊藻毒素分離純化的方法，將有毒藍藻水華干粉用乙酸水溶液為提取劑，采用經濟的大孔吸附樹脂D101作為分離純化材料，通過兩次過大孔吸附樹脂層析柱分離，洗脫液為不同濃度的乙醇-水溶液，得到微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR和微囊藻毒素-LR的乙醇水溶液；步驟為：

A.稱取有毒藍藻水華干粉，加入其重量20-30倍的5％的乙酸溶液，連續攪拌40-50min，用6000g離心10min，取上清液；沉淀按上述提取步驟重復提取一次，合并兩次提取上清，用0.45微米的濾膜過濾后旋轉蒸發，得微囊藻毒素乙酸提取濃縮液備用，濃縮液的重量為原料藍藻水華干粉重量的6-10倍；

B.大孔吸附樹脂D101層析柱，10×100cm，酒精浸泡樹脂24h后，依次用4％HCl、2％HCl各浸泡3-5h，去離子水洗成中性，將A步驟中的提取濃縮液調pH2.8-3.2后過柱，然后依次用為提取濃縮液一半體積的水、一半體積的15％乙醇淋洗，再依次用與提取濃縮液等體積的30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇洗脫，收集洗脫液；

C.將步驟B中獲得的30％乙醇洗脫液旋轉蒸發去乙醇后，再用上述同樣條件新處理的大孔吸附樹脂進行分離，過柱，然后用與步驟B同樣體積的15％乙醇淋洗，再用30％乙醇洗脫，分段收集洗脫液；用HPLC-UV/MS法測定，得到含微囊藻毒素-RR乙醇水溶液；

D.將步驟B中獲得的40％和50％乙醇洗脫液合并，旋轉蒸發去乙醇后，再用上述同樣條件新處理的大孔吸附樹脂進行分離，過柱，然后用與步驟B同樣體積的15％乙醇淋洗，再用40％乙醇洗脫，分段收集洗脫液；用HPLC-UV/MS法測定，分別得到微囊藻毒素-YR乙醇水溶液和微囊藻毒素-LR乙醇水溶液；

E.微囊藻毒素的純度檢測采用HPLC-UV/MS法測定，色譜柱：Symmetry?C18柱，2.1×150mm，3.0μm，柱溫30.0℃；流動相：乙腈-水-甲酸，體積比依次為30∶70∶0.1；流速：0.3ml/min；紫外-檢測器：238nm；液相色譜進樣體積：10μL；質譜條件：采用正電子電離方式，噴霧電壓3.7KV，脫溶溫度：300℃，離子源溫度：120℃，離子能量：1.0v，錐孔電壓：30-60V，掃描范圍：m/z＝400-1200；色譜峰面積歸一化法計算微囊藻毒素純度；由質譜信號判定色譜峰已基本分離。