[發明專利]二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因、該基因的克隆方法及其應用

無效

• 申請號: 200710189711.8
• 申請日: 2007-10-10
• 公開（公告）號: CN101407814A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發明（設計）人: 牛吉山;劉瑞;鄭磊
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/82
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 張 春

1.二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因，其特征是其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

3.根據權利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼的蛋白二級結構圖如SEQ?ID?NO：3所示。

4.如權利要求1所述基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)以二粒小麥的葉片為材料提取總RNA(核糖核酸)，再進一步分離mRNA(信使核糖核酸)，通過反轉錄將mRNA轉錄為cDNA(互補脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進行基因克隆。

(2)根據與植物抗病相關的LRR-類受體蛋白激酶基因序列設計了一對兼并性引物(序列為：5′-GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3′；5′-CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3′)，通過反轉錄PCR(RT-PCR)技術從二粒小麥cDNA中獲得編碼序列長度為3081bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T載體上，測序后通過序列分析證明這個cDNA克隆編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶。

5.根據權利要求4所述基因的克隆方法，其特征在于：

cDNA的合成方法包括：用試劑提取葉片總RNA，用Poly(A)mRNA分離系統III分離出mRNA，用SMART^TM?RACE?cDNA擴增試劑盒合成cDNA；

反轉錄PCR合成方法包括：用高保真DNA聚合酶進行擴增，擴增程序為：先在94℃變性2分鐘，接30個循環的94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，最后在72℃延伸7分鐘；

產物回收和測序分析：擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切割下來，用液氮反復凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉淀。回收的DNA片段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4℃連接過夜，用CaCl₂熱擊法，在42℃熱擊90秒，將連接產物轉化到大腸桿菌DH10B菌株中，用質粒小量提取法提取質粒DNA，測序儀測序，測序結果進行保守功能域數據分析。

6?根據權利要求1所述的基因在小麥抗白粉病中的應用。

7.根據權利要求1所述的基因在轉基因抗病育種中的應用。

8.根據權利要求1所述的基因在轉基因抗病育種中的應用。

9.根據權利要求1所述的基因在設計合成新抗病相關基因中的應用。

10.根據權利要求1所述基因在基因芯片制作研究中的應用，