[發(fā)明專(zhuān)利]建立巴西橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710184891.0
• 申請(qǐng)日: 2007-10-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101173245A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華玉偉;黃華孫;黃天帶;吳紫云;曾霞;胡彥師;李維國(guó);李哲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/02;C12N5/04
• 代理公司: 海口翔翔專(zhuān)利事務(wù)有限公司
• 代理人: 莫臻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種建立巴西橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法。

背景技術(shù)

天然橡膠為四大工業(yè)原料之一，也是極為重要的戰(zhàn)略物資。目前，在自然界大約2000余種產(chǎn)膠植物中，商品天然膠約99％來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)(Hevea?brasiliensis)。巴西橡膠樹(shù)屬大戟科橡膠樹(shù)屬多年生喬木，常規(guī)育種周期為20～30年，超長(zhǎng)的育種周期使巴西橡膠樹(shù)新品種選育和更新受到了很大的限制。為了拓寬巴西橡膠樹(shù)的育種途徑和創(chuàng)新育種方法，從上個(gè)世紀(jì)50年代以來(lái)，世界各國(guó)的育種工作者開(kāi)始研究生物技術(shù)在巴西橡膠樹(shù)育種中的應(yīng)用。花藥和內(nèi)珠被的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和胚胎植株再生的成功為巴西橡膠樹(shù)創(chuàng)造了新型種植材料：自根無(wú)性系。巴西橡膠樹(shù)存在兩個(gè)生理狀態(tài)：幼態(tài)和老態(tài)，大田試驗(yàn)已經(jīng)證明幼態(tài)橡膠樹(shù)較老態(tài)橡膠樹(shù)可增產(chǎn)10～50％，而通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得的自根無(wú)性系可以使老態(tài)幼態(tài)化。自根無(wú)性系的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用，將帶來(lái)巴西橡膠樹(shù)種植材料的革新和種苗生產(chǎn)模式的重大改變。

目前，巴西橡膠樹(shù)自根無(wú)性系主要通過(guò)兩種途徑獲得：花藥和內(nèi)珠被培養(yǎng)。其基本過(guò)程是：1)剝?nèi)魏丝窟吰诨ㄋ幓蛴啄鄯N子內(nèi)珠被進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)；2)將愈傷組織轉(zhuǎn)入體胚發(fā)生培養(yǎng)基，進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)；3)經(jīng)體胚發(fā)生誘導(dǎo)后，部分愈傷上會(huì)出現(xiàn)球形胚、子葉形胚等胚狀體；4)將成熟的子葉形胚轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生。

迄今，巴西橡膠樹(shù)自根無(wú)性系植株在多個(gè)國(guó)家已經(jīng)進(jìn)入大田生產(chǎn)試驗(yàn)，與傳統(tǒng)的芽接苗相比，自根無(wú)性系植株較芽接苗增產(chǎn)10～50％，這使得自根無(wú)性系植株將成為未來(lái)橡膠樹(shù)主要種植材料。然而，目前巴西橡膠樹(shù)自根無(wú)性系植株生產(chǎn)存在主要問(wèn)題是：花藥和內(nèi)珠被的獲得受季節(jié)的限制，無(wú)法廉價(jià)的、大量的、持續(xù)的、長(zhǎng)期的獲得胚性愈傷組織，無(wú)法對(duì)胚性愈傷組織進(jìn)行規(guī)模化的增殖，因而無(wú)法大量獲得自根無(wú)性系植株，進(jìn)而無(wú)法滿(mǎn)足大田生產(chǎn)對(duì)大量自根無(wú)性系植株的需求。為此，建立能大量的、持續(xù)的、長(zhǎng)期的和可快速擴(kuò)繁的獲得胚性愈傷組織的技術(shù)體系，將為大量獲得胚性愈傷組織和工廠化生產(chǎn)自根無(wú)性系植株尋求解決問(wèn)題的新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種建立巴西橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法，它利用傳統(tǒng)方法獲得花藥胚性愈傷組織，并將其接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，最終獲得懸浮細(xì)胞系。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的建立巴西橡膠樹(shù)懸浮細(xì)胞系的方法包括外植體的準(zhǔn)備過(guò)程、胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程、胚性愈傷組織繼代過(guò)程、胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)過(guò)程。

1、外植體的準(zhǔn)備過(guò)程：以巴西橡膠樹(shù)花蕾為外植體，對(duì)花蕾進(jìn)行表面消毒。

2、胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程：剝出消毒好的花蕾中的雄蕊，接種到誘導(dǎo)愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀、無(wú)水氯化鈣、四水硫酸錳和七水硫酸鎂的含量進(jìn)行調(diào)整，并添加2，4-D、KT、NAA、Phytagel、蔗糖、椰子水；

3、胚性愈傷組織繼代過(guò)程：將胚性愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；

4、胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)過(guò)程：將繼代后的愈傷組織破碎成顆粒，然后將愈傷組織顆粒接種到液體培養(yǎng)基中，置于搖床上進(jìn)行暗培養(yǎng)，然后再繼代培養(yǎng)，將大塊的愈傷組織去掉，將小的愈傷和細(xì)胞繼續(xù)繼代培養(yǎng)，即獲得懸浮細(xì)胞系；所述液體培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀、無(wú)水氯化鈣、四水硫酸錳和七水硫酸鎂的含量進(jìn)行調(diào)整，并添加2，4-D、KT、NAA、蔗糖、椰子水。

本發(fā)明的有益效果：

1、可大量、快速、持續(xù)、低成本的獲得胚性愈傷組織。本發(fā)明是在常規(guī)方法基礎(chǔ)上，利用少量花藥愈傷組織，建立增殖快速、可長(zhǎng)期繼代的懸浮細(xì)胞系，懸浮系建立后，將懸浮細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)誘導(dǎo)胚性愈傷組織，如此可長(zhǎng)期提供胚性愈傷組織，克服了常規(guī)方法的缺點(diǎn)。

2、懸浮細(xì)胞系是誘導(dǎo)巴西橡膠樹(shù)自根無(wú)性系極好材料，可以大大提高巴西橡膠樹(shù)自根無(wú)性系植株工廠化生產(chǎn)的效率和實(shí)現(xiàn)規(guī)模化砧木選育種研究。懸浮細(xì)胞系可以長(zhǎng)期的、持續(xù)的、大量的獲得胚性愈傷組織，可以實(shí)現(xiàn)胚性愈傷組織進(jìn)行大量的擴(kuò)繁，解決了傳統(tǒng)方法不斷采集花蕾或果實(shí)、不斷誘導(dǎo)胚性愈傷組織的重復(fù)、低效、繁重的體力勞動(dòng)，解決了大田生產(chǎn)對(duì)大量自根無(wú)性系植株的需求。

3、懸浮細(xì)胞系的建立拓展了巴西橡膠樹(shù)選育和遺傳改良的途徑。

4、為巴西橡膠樹(shù)生物反應(yīng)器的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。