[發明專利]建立巴西橡膠樹懸浮細胞系的方法

有效

• 申請號: 200710184891.0
• 申請日: 2007-10-25
• 公開（公告）號: CN101173245A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 華玉偉;黃華孫;黃天帶;吳紫云;曾霞;胡彥師;李維國;李哲
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02;C12N5/04
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司
• 代理人: 莫臻

1.一種建立巴西橡膠樹懸浮細胞系的方法，其特征在于：包括外植體的準備過程、胚性愈傷組織誘導過程、胚性愈傷組織繼代過程、胚性愈傷組織懸浮培養過程；

1)、所述外植體的準備過程是以巴西橡膠樹花蕾為外植體，用70-80％酒精對花蕾進行表面消毒30～60秒后，再用0.1％氯化汞消毒10～15分鐘，最后用無菌水沖洗3～6次，每次3～5分鐘；

2)、所述胚性愈傷組織誘導過程是剝出消毒好的花蕾中的雄蕊，接種到誘導愈傷的誘導培養基上于25～28℃的溫度進行暗培養，培養40～60天；所述誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，將MS培養基中的磷酸二氫鉀、無水氯化鈣、四水硫酸錳和七水硫酸鎂的含量調整為磷酸二氫鉀350-500mg/L、無水氯化鈣150-400mg/L、四水硫酸錳10-40mg/L、七水硫酸鎂400-600mg/L，并添加2，4-D0.5～3mg/L、KT?0.5～3mg/L、NAA?0.5～3mg/L、Phytagel?2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L；

3)、所述胚性愈傷組織繼代過程是將經過誘導的胚性愈傷組織在誘導培養基上繼代培養2～4次，每7～10天一次，暗培養，溫度為25～28℃；

4)、所述胚性愈傷組織懸浮培養過程是將繼代后的愈傷組織破碎成0.2～0.5cm顆粒，然后將2～6g愈傷組織顆粒接種到含20～60ml液體培養基的三角瓶中，置于90～110r/分鐘的搖床上，在溫度為25～28℃，暗培養，每7～10天繼代一次，繼代3～8次后，將大塊的愈傷組織去掉，將小的愈傷和細胞繼續繼代培養，即獲得懸浮細胞系；所述液體培養基是以MS培養基為基礎培養基，將MS培養基中的磷酸二氫鉀、無水氯化鈣、四水硫酸錳和七水硫酸鎂的含量調整為磷酸二氫鉀350-500mg/L、無水氯化鈣150-400mg/L、四水硫酸錳10-40mg/L、七水硫酸鎂400-600mg/L，并添加2，4-D?0.5～3mg/L、KT0.5～3mg/L、NAA?0.5～3mg/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L。