[發(fā)明專利]改進(jìn)G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性并且擴(kuò)展其pH范圍的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710180167.0
• 申請日: 2000-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN101173262A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 弗雷德·費(fèi)內(nèi)爾;奧西·特魯南;馬蒂·萊索拉
• 申請（專利權(quán)）人: 金內(nèi)克國際公司
• 主分類號(hào): C12N9/42
• 分類號(hào): C12N9/42
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所
• 代理人: 張紅春;封新琴

此案是申請日為2000年10月12日、中國申請?zhí)枮?0814240.8、發(fā)明名稱為“改進(jìn)G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性并且擴(kuò)展其pH范圍的方法”的發(fā)明申請的分案申請。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程，具體涉及G/11家族木聚糖酶，以及編碼所述酶的基因。本發(fā)明具體涉及編碼內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)的Trichoderma?reeseiXYNII基因。本發(fā)明描述了如何利用定點(diǎn)誘變改進(jìn)酶的性質(zhì)，以使其符合所要應(yīng)用的工業(yè)條件。可利用蛋白質(zhì)工程改進(jìn)木聚糖酶的熱活性和熱穩(wěn)定性，以及擴(kuò)展它們的pH范圍。

發(fā)明背景

木聚糖酶是水解β-1，4連接的吡喃木糖苷鏈的糖基水解酶。已發(fā)現(xiàn)木聚糖酶存在于至少一百種不同的生物中。它們與其它糖基水解酶一起形成了包括超過40種不同酶家族的超家族(Henrissat和Bairoch，1993)。木聚糖酶家族11(以前稱G)根據(jù)它們在基因序列，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，催化機(jī)制的相似性來確定。此家族成員的共同特點(diǎn)是高度的基因同源性，大小約20kDa，具有雙取代催化機(jī)制(Tenkanen等，1992；Wakarchuk等，1994)。

木聚糖酶家族11主要由形成2個(gè)大β-折疊的β-鏈和1個(gè)α-螺旋組成。它們形成了一個(gè)類似半握的右手的結(jié)構(gòu)，其中的β-折疊稱為A-折疊和B-折疊(Torronen&Rouvinen，1997)。由于木聚糖酶家族11的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且不易受蛋白酶活性的影響，所以它們在工業(yè)應(yīng)用方面特別有用。此外，木聚糖酶可以經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模生產(chǎn)。已知Trichoderma?reesei可以產(chǎn)生三種不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(XynI和XynII)具有最好的特點(diǎn)(Tenkanne等，1992)。XynI分子量19kDa，與XynII相比，它的等電點(diǎn)和最適pH較低(pI5.5，pH3-4)。XynII分子量20kDa，它的等電點(diǎn)為9.0，最適pH5.0-5.5(Torronen&Rouvinen，1995)。

木聚糖酶最重要的工業(yè)應(yīng)用是紙漿漂白，織物纖維的改良，生物質(zhì)的改良以促進(jìn)動(dòng)物飼料中它的消化(Prade，1996)。所有這些應(yīng)用中的共同問題是該酶面臨的極端條件。在工業(yè)應(yīng)用中的高溫以及與許多木聚糖酶的最適pH不同的pH條件降低了現(xiàn)有木聚糖酶在工業(yè)上的有效利用。

在飼料應(yīng)用中，該酶面臨飼料制備期間的短時(shí)高溫(例如90℃下2-5分鐘)。但是，該酶的催化活性需要的溫度較低(例如約37℃)。這樣，該酶應(yīng)在較低溫下保持活性，它不應(yīng)在高溫下不可逆地失活。

在應(yīng)用于紙漿漂白的過程中，來自于堿洗的物料具有較高的溫度(＞80℃)和pH(＞10)。沒有一種當(dāng)今市售的木聚糖酶可以在這樣的條件下不失活。必須將紙漿冷卻，將堿性pH中和，這樣才能用當(dāng)今可得的木聚糖酶進(jìn)行紙漿處理。但這意味著費(fèi)用提高。已有人利用蛋白質(zhì)工程-有時(shí)是成功的-穩(wěn)定木聚糖酶，使之耐受較高溫度和pH的變性效應(yīng)。

已從嗜熱生物中發(fā)現(xiàn)并克隆了幾種耐熱的，嗜堿和嗜酸的木聚糖酶(Bodie等，1995；Fukunaga等，1998)。但是，在大多數(shù)情況下，證明經(jīng)濟(jì)數(shù)量地生產(chǎn)這些酶是困難的。因此，工業(yè)上一般應(yīng)用不那么耐熱的T.reesei木聚糖酶II，因?yàn)樗梢源罅康统杀镜厣a(chǎn)。作為分離新的木聚糖酶或開發(fā)生產(chǎn)方法的替代方法，可以設(shè)想對(duì)當(dāng)今使用的木聚糖酶進(jìn)行工程改造，使之在極端條件下更為穩(wěn)定。

環(huán)狀芽胞桿菌木聚糖酶可以通過二硫橋?qū)⑵銷-末端與C-末端結(jié)合，將α-螺旋的N-末端部分與鄰近的β-鏈結(jié)合而改進(jìn)其穩(wěn)定性(Wakarchuk等，1994)。Campbell等(1995)也通過分子間或分子內(nèi)二硫鍵對(duì)環(huán)狀芽胞桿菌木聚糖酶進(jìn)行了修飾以提高其熱穩(wěn)定性。另一方面，T.reesei木聚糖酶II通過將N-末端區(qū)改變?yōu)槭葻崮揪厶敲傅南鄳?yīng)部分而改進(jìn)了穩(wěn)定性(Sung等，1998)。除熱穩(wěn)定性得到改進(jìn)外，所述酶也擴(kuò)展了在堿性pH條件下的活性范圍。單點(diǎn)突變(single?point?mutation)也用于提高短小芽胞桿菌木聚糖酶的穩(wěn)定性(Arase等，1993)。還對(duì)許多其它酶進(jìn)行了誘變對(duì)穩(wěn)定性影響的研究。通過對(duì)比嗜熱和嗜溫酶的結(jié)構(gòu)，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜熱木聚糖酶的結(jié)構(gòu)信息也給出了影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性因素的信息(Gruber等，1998；Harris等，1997)。

發(fā)明概述