[發(fā)明專利]一種使用混合吸附色譜分離純化貽貝粘蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710179491.0
• 申請(qǐng)日: 2007-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN101348520A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟桂鳳;邢思亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京康銘優(yōu)盛生化技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/36
• 分類號(hào): C07K1/36;C07K1/34;C07K4/12;C07K14/44
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離純化蛋白質(zhì)的方法，具體地是涉及一種使用混合吸附色譜分離純化貽貝粘蛋白的方法。

背景技術(shù)

貽貝粘蛋白(Mussel?adhesive?protein，MAP)，也叫紫貽貝足絲蛋白(Mytilus?edulis?foot?protein，Mefp)來自海洋貝類紫貽貝，Mytilus?edulis，它有在近海耐受波浪影響的能力，它在特殊腺體內(nèi)生成和儲(chǔ)存一種蛋白膠，通過足絲釋放到巖石一類的固體表面上，形成抗水的結(jié)合，從而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，蛋白膠形成了斑，從斑延伸開，有很強(qiáng)的抗張強(qiáng)度(10⁶-10⁷newton·meter^-2)，而斑內(nèi)物質(zhì)包含了貽貝粘蛋白MAP。

貽貝粘蛋白含有L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶對(duì)酪氨酸殘基的作用形成。L-DOPA殘基由于氧化反應(yīng)而相互交聯(lián)，交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致了貽貝和特殊表面纖維內(nèi)強(qiáng)而持久的膠接，其生物粘附的機(jī)理很有趣。貽貝粘蛋白粘附對(duì)人沒有毒性和免疫原性，結(jié)合能力和壽命不受水的影響，作為醫(yī)用手術(shù)尤其是眼科手術(shù)膠已經(jīng)引起注意。

全世界每年進(jìn)行1100萬例白內(nèi)障手術(shù)，我國白內(nèi)障的發(fā)病率非常高，50歲以上人群中白內(nèi)障發(fā)病率29.64％，70歲以上人群發(fā)病率高達(dá)60％。隨著社會(huì)老齡化的加劇，這一數(shù)字還會(huì)上升。目前醫(yī)生可以用兩種閉和方式結(jié)束眼科手術(shù)：讓傷口自行愈合或是用尼龍線縫合切口，每種閉合方法都各有缺點(diǎn)：自愈有感染和眼內(nèi)液體泄露的危險(xiǎn)；縫合會(huì)有感染發(fā)炎及血管發(fā)育異常的危險(xiǎn)。而貽貝粘蛋白能在低濃度下交聯(lián)，并形成可注射到不規(guī)則形狀部位的低粘性液體，這種溶液可凝固而填充到指定空間，在幾分鐘內(nèi)可封閉切口，少于縫合所需時(shí)間。貽貝粘蛋白還形成了一個(gè)不可破壞的封條，在大于正常人眼壓12倍的壓力下不會(huì)使眼內(nèi)液體發(fā)生泄露。貽貝粘蛋白具有和眼角膜近似的折射率，不會(huì)干擾光線到達(dá)視網(wǎng)膜。

另外，貽貝粘蛋白的生物降解性質(zhì)使其對(duì)環(huán)境很友好，也可用于其他領(lǐng)域，如通用的生化粘接試劑、醫(yī)用組織粘接及密封劑，醫(yī)用愈傷基質(zhì)，牙醫(yī)粘接和密封劑，醫(yī)用設(shè)備表面涂層試劑，水下作業(yè)設(shè)備涂層等。

貽貝粘蛋白中L-DOPA含量高于11％，富含多酚基團(tuán)，被認(rèn)為是多酚蛋白質(zhì)，它適宜作為氫鍵色譜吸附劑的理想純化目標(biāo)，這種高選擇性的反應(yīng)使從紫貽貝足絲粗提取物中一步純化貽貝粘蛋白蛋白質(zhì)成為可能。

貽貝粘蛋白純化通常將以下技術(shù)組合應(yīng)用：提取、鹽析、示差沉淀、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜、親和色譜和分子排阻色譜，但活性蛋白質(zhì)收率低僅為15％。工藝復(fù)雜，規(guī)模制備成本高、周期長，對(duì)pH值和鹽濃度敏感而導(dǎo)致穩(wěn)定性難控制，有必要研究新的色譜方法獲取高純度、高活性的貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白由于L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)的含量高達(dá)11％而富含多酚基團(tuán)被認(rèn)為是多酚蛋白質(zhì)。L-DOPA在膠纖維形成過程中的反應(yīng)性暴露在表面，其酚羥基是氫鍵供體，可使用包含適當(dāng)氫鍵受體的吸附劑的氫鍵色譜進(jìn)行分離；其苯環(huán)結(jié)構(gòu)可形成疏水鍵，可利用疏水相互作用進(jìn)行分離；賴氨酸氨基的正電荷，可形成靜電鍵。可利用貽貝粘蛋白結(jié)構(gòu)中的這些特點(diǎn)，以上述氫鍵吸附、疏水作用、靜電吸附三種原理進(jìn)行分離。

蛋白質(zhì)這類生物藥物或生物醫(yī)學(xué)材料的分離純化主要通過色譜技術(shù)及其組合，所用介質(zhì)材料主要是凝膠過濾、離子交換、疏水相互作用、親和、反相介質(zhì)，其基質(zhì)材料有瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅膠等。瓊脂糖介質(zhì)是目前生物醫(yī)藥研發(fā)和生產(chǎn)中使用最為普遍的規(guī)模制備用分離介質(zhì)，該基質(zhì)具有高孔度(90-96％)，即使在高濃度下也能保持高的孔度；具有連接纖維的開放的結(jié)構(gòu)；高的連通性有效保證了分子內(nèi)物質(zhì)傳遞；大比表面積可提供了很高的吸附能力易制備成不同瓊脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領(lǐng)域的需求；在氫氧化鈉中穩(wěn)定可滿足苛刻的在位清洗步驟；低的非特異性吸附使應(yīng)用面較廣；具有彈性及非脆性(較易實(shí)現(xiàn)柱子的再裝填)又可通過足夠的交聯(lián)步驟使介質(zhì)具有剛性(有較高的耐壓性能)；可用不同的活化步驟進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)而活化，可被大量配基取代而應(yīng)用于多種吸附色譜技術(shù)。本發(fā)明所涉及分離純化的核心技術(shù)采用瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服使用傳統(tǒng)方法純化貽貝粘蛋白收率低的問題，采用混合吸附色譜，即氫鍵吸附、疏水吸附、靜電吸附三種原理的吸附色譜，提供一種高選擇性、高收率的貽貝粘蛋白分離純化方法，簡化工藝，降低成本。

本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。