[發(fā)明專利]一步三重RT－PCR快速檢測百合三種病毒的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710178693.3
• 申請日: 2007-12-04
• 公開（公告）號: CN101220396A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 明軍;徐榕雪;劉春;穆鼎;湯庚國;王曉武;劉博
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及快速檢測百合三種病毒的方法。

背景技術(shù)

百合三種病毒LMoV、LSV和CMV是造成百合經(jīng)濟(jì)減產(chǎn)的主要原因，快速檢測是否帶有所述病毒，以便及時采取對策，挽回經(jīng)濟(jì)損失是上上之策。利用生物技術(shù)檢測病毒的方法包括1)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme?Linked?Immunosorbent?Assay，ELISA)。它是將抗原—抗體免疫反應(yīng)和酶高效催化過程有機(jī)結(jié)合在固相載體表面完成反應(yīng)的一項綜合技術(shù)。2)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)和簡并引物反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(IC-RT-PCR)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR，然后再利用其它檢測方法(如電泳、核酸探針等)對經(jīng)擴(kuò)增的病毒核酸進(jìn)行檢測。3)基因芯片技術(shù)是將無數(shù)預(yù)先設(shè)計好的寡核苷酸、cDNA、基因組(Genomic)DNA在芯片上做成點陣，與樣品中同源核酸分子雜交，通過熒光共聚焦顯微鏡掃描，利用計算機(jī)對每一個探針上的雜交信號作檢測、分析，從而反映目的材料中大量基因表達(dá)圖譜對樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析，大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息。上述方法中存在如下問題：

1)以血清學(xué)方法為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)是在實際生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，操作簡便，可用于大量樣品的檢測，但是相對該方法需要制備抗血清，常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性有待提高。

2)現(xiàn)有(IC-)RT-PCR大多一次只能檢測一種病毒，多重RT-PCR可以檢測出三種百合主要病毒，但是，假陰性反應(yīng)幾率很高，更關(guān)鍵的是現(xiàn)有RT-PCR一般不能確定擴(kuò)增出的條帶是否是假陽性。已有的多重RT-PCR，是將cDNA第一鏈的合成(反轉(zhuǎn)錄)與多重PCR二個步驟分開，耗時較長。已有的其他植物病毒種類的一步法RT-PCR均只能一次檢測一種病毒，而且大多數(shù)需要使用RNA提取試劑盒，或通過SephadexG-50-80微柱。費用高、過程復(fù)雜不能檢測超低病毒含量樣品，容易出現(xiàn)漏檢。

3)基因芯片技術(shù)為植物病毒的控制提供一條新的捷徑，但是，目前檢測百合病毒的芯片技術(shù)不夠成熟，芯片制作成本非常高，尚不適宜實際檢測需要。

現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一次能檢測上述三種病毒的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述的現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種檢測方法，能一次同時檢測出上述三種病毒，步驟少，效率高，結(jié)果精準(zhǔn)可靠。

一步三重RT-PCR快速檢測百合三種病毒的方法，包括cDNA的合成與三重RT-PCR擴(kuò)增步驟，其特征在于，所述三重RT-PCR擴(kuò)增體系中含有下列三對引物：

CMV1：5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG，

CMV2：5’-TCAGACTGGGAGCACTCCG；

LSV1：5’-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG，

LSV2：5’-TTTGTGTATCGATGATTTCGG；

LMoV1：5’-GCAAATGAGACACTTAACGCT，

LMoV1：5’-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG..

所述RT-PCR擴(kuò)增條件為：30個循環(huán)，72℃延伸5min，最后于4℃結(jié)束。

所述三重RT-PCR擴(kuò)增體系中加入的是總RNA提取物，eDNA的合成與三重RT-PCR擴(kuò)增體系是一步完成的。

所述cDNA的合成條件為：42℃下反轉(zhuǎn)錄30min，95℃4min，94℃20s，52℃30s，72℃40s，72℃5min，30個循環(huán)。

該方法中還包括假陽性檢測步驟，所述假陽性檢測是將PCR產(chǎn)物回收、純化、重組質(zhì)粒、PCR鑒定、再序列比對確定。

RT-PCR技術(shù)，由于PCR是對DNA的體外擴(kuò)增，而植物病毒大部分為RNA，所以先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA再以cDNA為模板進(jìn)行PCR，然后再利用其他檢測方法(如電泳、核酸探針等)對經(jīng)擴(kuò)增的病毒核酸進(jìn)行檢測。多重RT-PCR是在一個單一反應(yīng)體系中加入一對以上的特異引物對，從而同時擴(kuò)增多個序列的反應(yīng)過程。本發(fā)明針對CMV、LMoV和LSV三種病毒外殼蛋白CP基因保守序列設(shè)計了三對引物，利用該方法擴(kuò)增不同的目的片段。引物序列分別是：

CMV：上游引物5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG

及下游引物5’-TCAGACTGGGAGCACTCCG；

LMoV：上游引物5’-GCAAATGAGACACTTAACGCT

及下游引物5’-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG；