[發(fā)明專利]一種改進(jìn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化禾本科作物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710178499.5
• 申請日: 2007-11-30
• 公開（公告）號: CN101186926A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏勉;張會新;凌莉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/87
• 代理公司: 北京君尚知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所
• 代理人: 李稚婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化禾本科作物的方法與應(yīng)用，特別是涉及轉(zhuǎn)化甜高粱、谷子和玉米的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

糧食生產(chǎn)主要可分為兩種，一種是提供食用的糧食，一種是為生物能源提供原料的糧食。甜高粱是一種重要的能源植物。上世紀(jì)70年代的石油危機(jī)引發(fā)了人類對生物燃料代替石油的研究，美國和巴西用玉米和甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇獲得成功。現(xiàn)在，由于化石能源的漸趨枯竭和環(huán)保的需要，發(fā)展生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)成為許多國家的重要發(fā)展戰(zhàn)略。我國的糧食還不那么富裕。生產(chǎn)液體生物燃料還得找其他途徑。甜高粱有很高的光合效率，有“高能作物”之稱，是目前世界上生物學(xué)產(chǎn)量最高的作物。甜高粱莖稈中含糖豐富，是糧食生產(chǎn)酒精最好的替代物。每畝甜高粱的酒精產(chǎn)量約為玉米、甜菜和小麥的2倍；比甘蔗還高1/4；籽粒既可食用，又可作飼料和工業(yè)原料。我國有1億多公頃貧瘠的邊際性土地，如果種上能源植物，產(chǎn)出的燃油會相當(dāng)可觀。我國的汽車保有量2020年將達(dá)到2.2億輛，每年汽車就將消耗汽油2.2億噸，國內(nèi)目前的石油產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠用。種植利用甜高粱可以極大地緩解我國能源危機(jī)。

谷子起源于我國，我國的種植面積占世界的80％。谷子是糧草兼用型作物，它具有耐旱、耐瘠薄、抗逆性強、產(chǎn)量平穩(wěn)、營養(yǎng)價值高等特征。

玉米原產(chǎn)于南美洲，適合旱地種植。玉米是三大糧食品種之一，為解決人類的溫飽問題起到很大作用。此外飼料消費也是玉米最重要的消費渠道，約占消費總量的70％左右。作為工業(yè)原料使用也是玉米消費的主要渠道。玉米可開發(fā)產(chǎn)品眾多，是糧食作物中用量最大的工業(yè)原料。玉米廣泛用于生產(chǎn)淀粉、造紙、食品、紡織、醫(yī)藥等行業(yè)。以玉米淀粉為原料生產(chǎn)的酒精是一種清潔的“綠色”燃料，有可能在21世紀(jì)取代傳統(tǒng)燃料而被廣泛使用。

以上三種作物在我國的糧食生產(chǎn)中占重要地位，但目前對其研究還停留在常規(guī)育種上。因其難于進(jìn)行組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化再生能力差等問題，要應(yīng)用基因技術(shù)改良性狀，還比較困難。

目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可分為物理法、化學(xué)法及生物學(xué)法。無論那一種方法，都要依靠轉(zhuǎn)化細(xì)胞的脫分化和再分化這一組織培養(yǎng)植株再生過程，實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移，獲得轉(zhuǎn)基因植株。但是該途徑有其局限性，如組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化再生能力的基因型依賴性比較強，而且有些物種難于進(jìn)行組織培養(yǎng)，以及逃逸體、嵌合體、轉(zhuǎn)化率低下、過敏反應(yīng)導(dǎo)致感染部位的褐化壞死、細(xì)胞脫分化和再分化中產(chǎn)生的體細(xì)胞變異以及轉(zhuǎn)基因株的育性降低或喪失都有可能干擾轉(zhuǎn)基因植株的分析及應(yīng)用。植物原位轉(zhuǎn)基因方法是一種不需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)手段而達(dá)到植物在活體而非離體手段狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化。浸花法轉(zhuǎn)化是植物原位轉(zhuǎn)基因方法中的一種，是利用材料花序與農(nóng)桿菌接觸，在活體條件下，完成可遺傳細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并通過對后代的篩選，獲得轉(zhuǎn)化株。目前浸花法轉(zhuǎn)化已應(yīng)用于雙子葉植物十字花科的蕓薹屬作物中并獲得成功，利用浸化花法轉(zhuǎn)化禾本科作物未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的浸花法轉(zhuǎn)化禾本科作物的方法。

本發(fā)明所提供的浸花法轉(zhuǎn)化禾本科作物的方法包括以下步驟：

1)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸浮，所述滲透培養(yǎng)基含有Silwet?L-77、曲拉通X-100(Triton?X-100)和赤霉素(GA)；

2)在活體條件下進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化：將待轉(zhuǎn)化的目的植株的全部花序或雌蕊部分浸泡于上述滲透培養(yǎng)基中，或者將上述滲透培養(yǎng)基噴灑于花序或雌蕊上，利用農(nóng)桿菌將目的基因整合到目的植株基因組中。

浸花法轉(zhuǎn)化可在外界的強壓下進(jìn)行，也可在常溫常壓下進(jìn)行。目前應(yīng)用較多的浸花法轉(zhuǎn)化要進(jìn)行抽真空處理，但是對于株型較大的植物品種進(jìn)行抽真空處理則不太可行。在常溫常壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，滲透培養(yǎng)基中需要添加能夠幫助提高滲透能力的表面活性劑，通常添加的是有機(jī)硅表面活性劑Silwet?L-77。在本發(fā)明的研究中，除了Silwet?L-77外，還首次添加了另外兩種成分：Triton?X-100(曲拉通X-100)和GA。Triton?X-100是一種非離子表面活性劑，可作為潤濕劑、乳化劑、清潔劑使用，它能夠溶解脂質(zhì)，增強細(xì)胞膜的通透性，使農(nóng)桿菌更容易進(jìn)入植物體內(nèi)。GA即赤霉素，能促進(jìn)細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)植物發(fā)芽，刺激植物生長，特別是促進(jìn)開花器官的發(fā)育。滲透培養(yǎng)基中一些成分的毒性，往往會影響早期尚未發(fā)育成熟花的生長，降低結(jié)實率，而研究表明這部分花更容易被轉(zhuǎn)化。向滲透培養(yǎng)基中添加GA，可以使轉(zhuǎn)化后的花器官更好的發(fā)育，從而提高轉(zhuǎn)化效率。