[發(fā)明專利]一種PEG化重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子的分離純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710175657.1
• 申請日: 2007-10-10
• 公開（公告）號: CN101407547A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張樹祥;熊國裕
• 申請（專利權(quán)）人: 北京星昊嘉宇醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C07K17/08
• 分類號: C07K17/08;C07K1/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種改構(gòu)人腫瘤壞死因子的分離純化方法，特別涉及一種經(jīng)PEG化后的改構(gòu)人腫瘤壞死因子的分離純化方法。

背景技術(shù)

腫瘤壞死因子(TNF)主要是由巨噬細胞產(chǎn)生的一種非糖基化可溶性多功能細胞因子，由157個氨基酸組成。其主要生物學活性是能夠較為特異地殺傷多種腫瘤細胞，將天然的TNF的1-7位氨基酸缺失，Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰用ArgLysArg取代，同時將Leu1⁵⁷用Phe取代，得到一種新型改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmhTNF)，此突變體提高了其抗腫瘤活性，降低了毒副作用，但是其仍然存在不穩(wěn)定，血漿半衰期短等缺點。

聚乙二醇(polyethylene?glycol，PEG)是一種具有廣泛用途的非離子線型高聚物。在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，它常用于蛋白質(zhì)的PEG化。在生物分離純化領(lǐng)域，PEG可用作鹽析劑，除去細胞碎片和部分雜蛋白；隨形成包涵體的基因重組蛋白質(zhì)的折疊復性，PEG能有效地減少倍分離蛋白質(zhì)的聚合失活，從而顯著地提高活性蛋白質(zhì)的回收率。國際上用聚乙二醇化學修飾生物活性蛋白質(zhì)的研究從先導性探索進入產(chǎn)品開發(fā)階段，對被修飾蛋白的分離純化方法、修飾度及結(jié)構(gòu)測定是該類產(chǎn)品開發(fā)的核心與難點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種分離純化經(jīng)PEG修飾的重組人腫瘤壞死因子的方法。

本發(fā)明的方法包括如下步驟：

(1)采用常規(guī)的方法進行裂菌：基因工程菌由中國預防科學院病毒所基因工程國家重點實驗室提供，宿主菌為JM103。在搖瓶的LB培養(yǎng)液(含12.5mg.L^-1鹽酸四環(huán)素)中振蕩培養(yǎng)8小時作為種子，按5％接種量接入發(fā)酵灌中，37℃、260rpm、0.5-0.6vvm、pH7.5的條件下培養(yǎng)12小時，離心，棄去上清液，收集菌體。將洗滌好的菌體充分懸浮于0.01M、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，用珠磨破碎3-5分鐘。破碎液于4℃、1500rpm離心30分鐘，除去細胞碎片，取上清液為rhTNF-α粗品。

(2)rhTNF-α粗品的PEG化：在rhTNF-α粗品中，加入2-4倍于rhTNF-α質(zhì)量的活化PEG，于HEPES(10mmol/L，pH8.0)緩沖液中，在4℃條件下，進行共價結(jié)合，反應(yīng)0.25-2小時，取樣。

上述的活化PEG可以是NHS-PEG2、PEG-MAL、SPA-PEG、NHS-PEG-MAL中的任一種，優(yōu)選NHS-PEG-MAL，所用的PEG的分子量為PEG600，其用量優(yōu)選為rhTNF-α粗品重量的2.5倍，共價結(jié)合時間優(yōu)選為1小時。

(3)PEG化的rhTNF-α的分離純化：將DEAE-陽離子樹脂裝柱Φ1.0cm×20cm，用緩沖液A(0.01M、pH8.0的Tris-HCl溶液)平衡離子樹脂柱，緩沖液用量約為4-5個柱體積，以約2-3mL/min流速將PEG化的rhTNF-α粗品上樣，用平衡緩沖液B(0.01M、pH8.0的Tris-HCl緩沖液含5％的PEG600)淋洗2-4個柱體積至淋洗液至基線，然后以緩沖液A充分淋洗除去PEG，再用緩沖液C(0.075M的NaCl溶于緩沖液A中)分段洗脫，收集目的峰產(chǎn)物，即得純化后的PEG化rhTNF-α。

結(jié)果：PEG化的rhTNF-α穩(wěn)定性大大增強，經(jīng)DEAE-離子交換柱層析純化后，可得到比活性為2.15-4.11×10⁷U/mg的rhTNF-α，總活性回收率達90％以上，原液各項指標符合質(zhì)量標準。

本發(fā)明中的一些縮寫的相關(guān)說明：NHS-PEG2為琥珀酰亞胺二聚乙二醇，PEG-MAL為馬來酰亞胺聚乙二醇，SPA-PEG為琥珀酰亞胺丙酸酯聚乙二醇，NHS-PEG-MAL為琥珀酰亞胺-聚乙烯二醇-馬來酸亞胺。

具體實施例

實施例1