[發(fā)明專利]脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結核基因疫苗及其制備和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710172046.1
• 申請日: 2007-12-11
• 公開（公告）號: CN101455846A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發(fā)明（設計）人: 徐薇;熊思東;岳艷;高海峰
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/04;C12N15/31;C12N15/79;A61P31/06
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司
• 代理人: 嚴新德

技術領域

本發(fā)明涉及生物基因工程領域，尤其涉及用于預防或治療結核病的疫苗及其制備方法和應用，特別是一種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結核基因疫苗及其制備和應用。

背景技術

結核分枝桿菌感染導致的結核病的死灰復燃是當今全球重大的健康問題，由于人口密集度和流動性日益增加、常規(guī)BCG疫苗的無效性、結核耐藥菌株的出現(xiàn)、以及AIDS病導致的結核并發(fā)感染，目前結核發(fā)病及死亡非常嚴重，全球每年有800萬活動性結核患者并導致300萬死亡；我國約有5.5億人口曾經感染結核，每年13萬人死于結核，每月約有12萬新發(fā)病人。2006年結核已一躍成為我國感染性疾病發(fā)病的首位，研制新型結核預防疫苗非常迫切。

結核研究表明，結核桿菌主要感染肺部巨噬細胞。誘導Th1型的細胞免疫應答對于清除結核桿菌至關重要，誘導CD4+Th1及其分泌的高水平的IFNγ，不僅能夠增強巨噬細胞的吞噬和殺菌能力，還可以通過促進CD8+CTL的誘導發(fā)揮特異性殺傷結核感染細胞，發(fā)揮免疫保護作用。基因疫苗或稱DNA疫苗，是將外源目的基因構建于真核表達質粒、直接注射動物的第三代疫苗，由于可在體內表達目的抗原，通過外源性、內源性以及交叉抗原提呈途徑被DC細胞提呈，有效激活CD4+Th1和CD8+T細胞，因此特別有利于誘導Th1型免疫應答。

除誘導Th1型細胞免疫應答至關重要以外，誘導肺粘膜局部的粘膜T細胞免疫應答同樣非常關鍵。結核桿菌主要通過呼吸道粘膜入侵機體，粘膜免疫是人體免疫的第一道防線，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染擴散。誘導呼吸道和肺部特異性粘膜免疫應答，對于有效控制結核早期感染具有非常重要的意義，因此結核特異性粘膜免疫的誘生成為新型結核疫苗研制的熱點問題。通過呼吸道給予DNA疫苗可更好地模擬結核桿菌的天然感染，誘導特異性粘膜免疫，在粘膜局部感染的第一時間清除病原體，可能會產生更為有效的抗結核免疫保護作用。

然而，通常粘膜部位接種抗原通常很難誘導免疫應答，這是由于粘膜局部纖毛的頻繁擺動、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外來抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通過粘膜疫苗遞送系統(tǒng)來對DNA疫苗進行組裝，而后在粘膜部位免疫。

因此，應用申請人過去申請的脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)(一種含粘膜佐劑的脫乙酰殼聚糖粘膜遞送系統(tǒng)和其應用。專利申請?zhí)枺?00610147575.1)，根據(jù)這一專利的方法，再以申請人過去申請的基于T細胞表位的結核基因疫苗(基于T細胞表位的結核基因疫苗及其制備方法和應用。專利申請?zhí)枺?00710171416.X)為基礎，以特定性質的一種chitosan天然多糖通過共聚沉淀的方法與結核基因疫苗形成chitosan-DNA納米顆粒復合物，而后進行滴鼻免疫，誘導結核特異性全身和肺部T細胞應答。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的在于提供一種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結核基因疫苗及其制備和應用，所述的這種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結核基因疫苗要解決現(xiàn)有技術中由于常規(guī)BCG疫苗的無效性、以及結核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS病導致的結核伴發(fā)感染使得現(xiàn)有疫苗預防和治療結核病的效果不佳的技術問題。

本發(fā)明提供了一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結核基因疫苗，由脫乙酰殼聚糖與結核抗原編碼質粒組成，所述的結核抗原編碼質粒由一個載體構成，在所述的載體中插入有結核桿菌熱休克蛋白的全長基因，所述的結核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因中嵌合有來自結核桿菌抗原的4個T細胞表位多肽基因，所述的4個T細胞表位分別是結核桿菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，結核桿菌Ag85A蛋白的369～405位基因，結核桿菌CFP-10蛋白的162～207位基因，結核桿菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

進一步的，所述的載體為真核表達質粒，所述的真核表達質粒選自pcDNA3.1質粒、或pVAX1質粒。

進一步的，所述的結核桿菌的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

進一步的，所述的結核桿菌的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：2所示。

進一步的，所述的結核桿菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

進一步的，所述的結核桿菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：4所示。

進一步的，所述的結核桿菌Ag85A蛋白的369～405位基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。