[發明專利]一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記及其建立方法

無效

• 申請號: 200710171121.2
• 申請日: 2007-11-28
• 公開（公告）號: CN101445823A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 薄洋
• 申請（專利權）人: 薄洋
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及分子標記的建立方法，尤其涉及與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記的建立方法。

背景技術：

亞麻(Linum?usitatissimum?L.)是重要的纖維和油料作物。亞麻的莖稈可以剝取高檔纖維用于紡織業，籽粒可以榨制富含高不飽和脂肪酸的營養保健油品。隨著人們生活水平的提高，發展亞麻生產顯得越來越重要。長期以來亞麻生產受到許多病害的影響，其中由亞麻銹病菌(Melampsora?liniEhrenb.Lev.)引起的銹病是世界性的亞麻病害。篩選和培育抗病品種是防治亞麻銹病最為經濟、安全和有效的方法。

但是，目前抗銹病亞麻品種的選育都是依靠傳統的育種方法，需要在田間進行銹病抗性的選擇鑒定，周期長，工作量大。另外，抗銹病性狀受遺傳背景及環境因素影響較大，給依靠表型選擇造成了困難。近幾年發展起來的分子標記輔助育種技術，為植物育種學家提供了一條新的途徑。該技術是將分子標記技術與傳統育種學相結合，用穩定、可靠的DNA分子標記代替易受環境影響的表型標記，對育種材料進行篩選。利用分子標記輔助育種的關鍵是篩選到與目標基因緊密連鎖的分子標記，因此，開發研究一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記的建立方法，以滿足有關方面的需要，將具有十分重要的意義。

發明內容：

本發明需要解決的技術問題是公開一個與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記及其建立方法，以滿足有關方面的需要。

本發明的技術構思是這樣的：

本發明根據“群體分離分組法(bilked?segregant?analysis，BSA)”的原理，利用亞麻抗銹病材料與感銹病材料的雜交分離群體，通過RAPD技術開展亞麻抗銹病基因分子標記研究，尋找與亞麻抗銹病基因連鎖的RAPD標記，以用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種。

1、本發明所說的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，其特征在于，所述的分子標記OPA18₄₃₂，是用下述方法得到的：

(1)、按照潘家駒主編的《作物育種學總論》(中國農業出版社2003年出版)所敘述的亞麻雜交和自交方法，將上海市農業科學院園藝研究所保存的的亞麻高抗銹病的親本NM4和高感銹病親本Bison進行雜交，得到F1代，再經過自交獲得F2分離群體。

(2)、用SDS方法(在本文的具體實施方式中有詳細描述)提取F2代單株的DNA，并選取10株高抗銹病的單株DNA等量混合為抗病池(R池)，選取10株高感銹病的單株DNA混合為感病池(S池)；

(3)、利用兩個親本和兩個基因池篩選引物，再利用獲得的候選引物對F2代單株進行PCR擴增，驗證多態片段的穩定性；

(4)、篩選出的分子標記OPA18₄₃₂，經過連鎖性鑒定，與亞麻抗銹病基因相連鎖。

2、與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記是采用RAPD分子標記進行篩選的，具體的方法是：

(1)、親本間和基因池間DNA多態性分析：

采用上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸作為隨機引物，在Mastercycler?5333型PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20μl，其中25mmol/L?MgCl₂?2.0μl，10×PCR?Buffer?2.0μl，10mmol/L?dNTP?0.5μl，5U/μLTaq?E?0.5μl，20ng/μl?Primer?2.0μl，10ng/μl模板DNA3μl，滅菌雙蒸水10μl，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，40個循環；72℃延伸10min后15℃保存。RAPD擴增產物電泳分析采用濃度為15g/L的瓊脂糖凝膠(含0.15ng/LEB)，電泳緩沖液為1×TAE，保持90V恒壓(4～5V/cm)電泳1.5～2h，凝膠成像儀成像分析。

(2)、分子標記的連鎖性鑒定：

在同一條件下鑒定F₂代分離群體的銹病發生情況。用Mapmaker/3.0軟件對分離群體單株的銹病抗性和分子標記的分離數據進行連鎖分析，利用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距cM(centimorgan)。所說的Mapmaker/3.0軟件在生物谷網站(http://www.bioon.com/Soft)可以下載。

本發明的與亞麻抗銹病基因相連鎖的分子標記，可用于亞麻抗銹病的早期鑒定和針對該特性的分子標記輔助育種。