[發(fā)明專(zhuān)利]用于測(cè)量磷酸修飾酶活性的測(cè)定法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710159672.7
• 申請(qǐng)日: 2007-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101205556A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 甘清芬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 弗·哈夫曼－拉羅切有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/42
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/42;C12Q1/44;C12Q1/25;C12Q1/48;G01N21/64
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及對(duì)催化磷酸修飾的酶的生物檢測(cè)。

發(fā)明背景

蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化通常被細(xì)胞用作應(yīng)對(duì)外來(lái)刺激的常用信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。進(jìn)行這些磷酸修飾的蛋白質(zhì)是被稱(chēng)為激酶(磷酸化)和磷酸酶(脫磷酸化)的酶。根據(jù)被磷酸化(或脫磷酸化)的氨基酸殘基，激酶和磷酸酶被分為兩個(gè)家族：酪氨酸激酶(磷酸酶)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(磷酸酶)。其他在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的酶包括產(chǎn)生環(huán)核苷酸(例如環(huán)AMP(cAMP)和環(huán)GMP(cGMP))的環(huán)化酶和水解環(huán)核苷酸形成相應(yīng)非環(huán)單磷酸核苷酸(即AMP和GMP)的磷酸二酯酶，所述環(huán)核苷酸環(huán)AMP(cAMP)和環(huán)GMP(cGMP)是重要的第二信使。因?yàn)樗鼈冊(cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞功能中的重要作用，所有這些酶是探索和開(kāi)發(fā)新的藥物療法的重要靶分子。

傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法依賴(lài)于放射性³²P-正磷酸的摻入。³²P-磷酸化的蛋白質(zhì)在凝膠上分離，然后用磷光顯像儀觀(guān)察?；蛘撸姿峄野彼釟埢梢酝ㄟ^(guò)結(jié)合放射性標(biāo)記抗-磷酸酪氨酸抗體，利用免疫測(cè)定法例如免疫沉淀或者印跡進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)檫@些方法需要檢測(cè)放射性同位素，它們是耗時(shí)的，而且由于處理放射性物質(zhì)時(shí)涉及安全問(wèn)題，它們不適合進(jìn)行超高通量篩選(uHTS)。

在最近的方法中，放射性免疫測(cè)定法被ELISA(酶聯(lián)免疫測(cè)定法)取代。這些方法利用固定在底物表面的純化的底物蛋白質(zhì)或者合成肽底物。激酶反應(yīng)后，通過(guò)抗-磷酸酪氨酸抗體與例如磷酸化的固定底物的結(jié)合來(lái)定量磷酸化程度，所述抗體偶聯(lián)有增強(qiáng)酶例如過(guò)氧化物酶。

Epps等人(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,203,994)描述了針對(duì)蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶的熒光HTS測(cè)定法，利用了熒光標(biāo)記的磷酸化報(bào)告分子和特異結(jié)合磷酸化報(bào)告分子的抗體。利用熒光偏振法，熒光猝滅法或者熒光關(guān)聯(lián)譜法(FCS)檢測(cè)結(jié)合。這種方法具有內(nèi)在缺陷，只有優(yōu)良類(lèi)別的抗體(例如克隆PT66、PY20，Sigma)才能用作磷酸酪氨酸底物。只有少量合適的抗-磷酸絲氨酸或者抗-磷酸蘇氨酸抗體的實(shí)例被報(bào)道(例如Bader?B.等人，Journal?ofBiomolecular?Screening，6，255(2001)，Panvera?kit?no.P2886)。但是這些抗體的特性是不僅識(shí)別磷酸絲氨酸而且識(shí)別相鄰氨基酸為抗原表位。但是已知激酶作用對(duì)底物是非常特異的，底物序列可能差別很大。因此，抗-磷酸絲氨酸抗體不能用作類(lèi)別試劑。

Perkin?Elmer(Wallac)提供了測(cè)定酪氨酸激酶的方法，它基于時(shí)間分辨熒光和從銪螯合物到別藻藍(lán)蛋白的能量轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)EP?929?810)。由于使用了抗體，此處該方法也僅限于酪氨酸激酶。

最近，Molecular?Device(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,070,921)提供表面帶有鎵陽(yáng)離子的納米顆粒作為類(lèi)別結(jié)合試劑，所述結(jié)合試劑適于檢測(cè)激酶和磷酸酶活性的磷酸化反應(yīng)，以及檢測(cè)環(huán)化酶和磷酸二酯酶活性的核苷酸環(huán)化和解環(huán)反應(yīng)。

發(fā)明概述

本發(fā)明描述基于金屬離子銦(III)和鋯(IV)特異結(jié)合磷酸化分子的能力來(lái)檢測(cè)催化其底物磷酸修飾的酶活性的測(cè)定法。該測(cè)定法可用于酶例如磷酸化或者脫磷酸化多肽分子的激酶和磷酸酶，和用于酶例如環(huán)化或者解環(huán)核苷酸分子的環(huán)化酶和磷酸二酯酶。

因此，本發(fā)明提供用于測(cè)定能夠催化底物磷酸修飾以生成產(chǎn)物的酶活性的方法，所述方法包括在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在的條件下將底物與酶接觸的步驟，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子可以結(jié)合底物或者產(chǎn)物但不能與兩者都結(jié)合；檢測(cè)銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度；將結(jié)合程度和酶活性對(duì)應(yīng)；其中酶選自激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶組成的組。

本發(fā)明還提供篩選調(diào)節(jié)酶活性的物質(zhì)的方法，所述酶催化底物進(jìn)行磷酸修飾生成產(chǎn)物，所述方法包括在存在或不存在所述物質(zhì)，以及存在銦(III)離子或者鋯(IV)離子的條件下，將底物與酶接觸的步驟，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子可以結(jié)合底物或者產(chǎn)物但不與兩者都結(jié)合；檢測(cè)銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度；測(cè)定該物質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)合程度的能力，所述結(jié)合程度與酶活性有關(guān)；其中酶選自激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶組成的組。

通過(guò)考慮下面的發(fā)明詳述并結(jié)合示范性說(shuō)明實(shí)施方案的附屬實(shí)例，將更容易理解本發(fā)明的上述和其他優(yōu)點(diǎn)和特征以及完成相同內(nèi)容的方式。

附圖簡(jiǎn)述