[發明專利]固定化黑芥子酶及其制備方法

無效

• 申請號: 200710156139.5
• 申請日: 2007-10-19
• 公開（公告）號: CN101173266A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 王向陽;施青紅;沈蓮清
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12N11/04
• 分類號: C12N11/04;C12N9/14
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，涉及一種固定化酶及其制備，具體為一種從植物中分離并直接固定化的黑芥子酶，及其制備方法。

背景技術

黑芥子酶主要存在于十字花科植物中。在一定的條件下，黑芥子酶可以將硫代葡萄糖苷分解，生成葡萄糖、硫酸鹽、異硫代氰酸鹽、乙腈、硫氰酸鹽等物質。其中許多異硫代氰酸鹽具有生物活性，具有比較好的抗癌效果。

目前，在國際上有多種從不同十字花科植物中提取分離黑芥子酶的報道，但游離的黑芥子酶存活時間很短，在酶解催化反應中也很難重復使用，因為該酶含有6對二硫鍵，酶在提純過程中容易受重金屬離子危害，并對氧化還原很敏感。而其粗酶往往混有蛋白酶等，也容易造成其水解失活。因此，該酶難以作為酶制劑應用于工業中。如果將游離的黑芥子酶固定化，可以提高該酶的利用率，使之能適合于現代工業應用的要求，這對于黑芥子酶的工業化應用顯得十分有意義。

將游離酶的催化活動完全或基本上限制在一定空間內的過程稱為固定化。它解決了酶的工程化應用中存在的問題，極大地提高了酶的應用價值，促進了酶工程地飛躍發展。日本在上世紀六十年代就實現了固定化酶的工業化應用，在世界上開創了固定化酶應用于工業生產的先例。我國固定化酶的研究起步較晚，開始于1970年。目前能夠采用固定化技術的酶種類還比較少。采用固定化酶技術大規模生產的企業更少。其原因一方面是適合固定化的酶，其底物和產物分子量應該都比較小。另一方面是酶固定化后容易失活。

黑芥子酶的固定化研究目前還未見報道。黑芥子酶作用對象硫代葡萄糖苷和酶解產物分子量都比較小，屬于可以使用固定化技術的酶。黑芥子酶的分子量和一些蛋白酶的分子量差異比較小，其分離比較困難。如果將黑芥子酶粗酶進行固定化就可以減少蛋白酶對其的攻擊，延長其使用時間。黑芥子酶又可以重復使用。但是黑芥子酶含有大量二硫鍵，是一種容易失活的酶。其固定化難度比較大。

發明內容

本發明經過多次試驗，獲得了比較好的黑芥子酶固定化方法。本發明的目的是提供一種固定化黑芥子酶，并提供適合于黑芥子酶的固定化方法。

本發明提供的固定化黑芥子酶，是從十字花科蔬菜種子或植株中分離獲取黑芥子酶，制成2mm～3mm的海藻酸鈣凝膠珠，硬化后用戊二醛交聯而成。

本發明的固定化黑芥子酶其制備方法包括以下步驟：

(1)按每克十字花科蔬菜種子粉末加3毫升pH為6.0的磷酸緩沖液計加入磷酸緩沖液，攪拌過濾除雜后，再4℃低溫離心去雜質，獲黑芥子酶液；所述磷酸緩沖液中含5％體積份的甘油，1mM?EDTA，3mM?DTT；

(2)按體積/重量比計在上述酶液中加80％硫酸銨，4℃低溫靜置2小時后，在4℃條件下離心，獲得酶沉淀，4℃下蒸餾水透析2小時，獲得液體酶；

(3)在液體酶中加入海藻酸鈉，添加量為每100毫升酶液加入3.5～4.5毫克海藻酸鈉，35℃～45℃水浴溶解海藻酸鈉，將混合液呈小滴狀滴加到2％～3％氯化鈣水溶液中，形成直徑2mm～3mm的海藻酸鈣凝膠珠；

(4)將海藻酸鈣凝膠珠在3℃～5℃靜置硬化2小時，用蒸餾水洗滌后，取顆粒加入到0.15％～0.3％的戊二醛溶液交聯4小時，再用蒸餾水洗滌，得到固定化黑芥子酶顆粒，在3℃～5℃密封保存。

步驟(1)所述十字花科蔬菜種子選用西蘭花種子可以提高固定化黑芥子酶的活性。

上述步驟概括如下：

將西蘭花種子或其他十字花科蔬菜種子碎成粉末，加pH為6.0的磷酸緩沖液，其中含5％甘油，1mM?EDTA，3mM?DTT，將其攪拌后紗布過濾，將濾液在4℃下，12000×g離心20min，收集上清夜，按體積重量比加80％硫酸銨，在4℃下靜置2h后，4℃下12000×g離心20min，收集沉淀，4℃下蒸餾水透析2h，截留分子量為14000D，取透析袋內酶液，將海藻酸鈉加入酶液中混合，海藻酸鈉添加量為3.5～4.5％(w/v)，35℃～45℃水浴溶解海藻酸鈉后，將混合液呈小滴狀加入到氯化鈣溶液中，氯化鈣含量為2％～3％(w/v)，形成2mm～3?mm的海藻酸鈣凝膠珠，于3℃～5℃硬化2小時后蒸餾水洗滌，再加入到戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液濃度為0.15％～0.3％(w/v)，交聯4小時后蒸餾水洗滌，獲得的固定化黑芥子酶于3℃～5℃密封保存。

本發明方案中：二硫蘇糖醇(DTT)可以保護游離巰基免被氧化。乙二胺四乙酸(EDTA)是金屬螯合劑，能避免酶受重金屬離子危害。甘油對不少酶具有保護作用，防止蛋白質脫水。