[發明專利]雞主要組織相容性復合體/肽四聚體的構建方法及其產品

有效

• 申請號: 200710152068.1
• 申請日: 2007-09-28
• 公開（公告）號: CN101397562A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 吳東來;劉光亮;王群;肖一紅;童鐵鋼;白宇;張維軍;徐樹蘭;張文龍;殷喆
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N1/21;C07K19/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發明涉及主要組織相容性復合體(MHC)I類分子四聚體的構建方法，尤其涉及一種雞主要組織相容性復合體/肽四聚體的構建方法及由該方法構建得到的四聚體，屬于基因工程領域。

背景技術

主要組織相容性復合體(MHC)I類分子四聚體技術自1996年Altman等首次報道以來，已成為研究特異性CD8⁺T細胞免疫特性的重要技術，被廣泛應用于包括SARS-CoV在內的病毒性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤等基礎和臨床免疫學研究領域。

MHC?I類分子由一條45kD的重鏈(α鏈)和12kD的輕鏈(β鏈)經非共價鍵結合而成，其中重鏈由多個基因位點和多種等位基因所編碼，共顯性表達，呈高度多態性；成熟的α鏈由α1、α2、α3結構域組成，抗原結合槽位于α1和α2結構域之間，在抗原遞呈過程中起著重要作用；而β2m對維持MHC?I類分子天然構型的穩定性及其表達起關鍵作用。

MHC?I類分子四聚體是通過生物素-親和素的作用，將四個MHC-肽復合物連成一個四聚體。首先，設計特異的引物擴增MHC?I類分子的胞外區，并在其COOH端加上15個氨基酸的BirA酶底物肽(BSP)；表達MHC?I類分子融合蛋白，將其與β2m和特定病原的特異性T細胞表位肽進行體外折疊，形成MHC-β2m-肽復合物，并純化該復合物；MHC-β2m-肽復合物在BirA酶的作用下被生物素標記；生物素標記的MHC-β2m-肽復合物與熒光標記(PE或FITC)的親和素以4∶1的比例相混合，即得到熒光標記的四聚體。因此，獲取大量純化的MHCIα及β2m是制備抗原特異性MHC四聚體的必備條件之一。

目前，人MHC(即人白細胞抗原，HLA)、鼠MHC(即H-2)以及猿猴MHC?I類分子四聚體技術都已得到廣泛深入的研究，豬MHC(SLA)、馬MHC(ELA)四聚體的相關研究也已起步。然而迄今為止，還未見到雞MHC?I類分子(BF)四聚體技術的相關報道及應用。

MHC?I類分子-肽復合物的制備最先由Garboczi等報道，將人MHC?I類分子HLA-A2和β2m基因克隆于原核表達載體，在大腸桿菌分別表達并可大量提純一種可溶性分子，而后將其與HIV-1gp120包膜蛋白中的九肽以摩爾比1∶2∶40于4℃透析過夜混合(透析法)，或與肽共同稀釋于200ml緩沖液10℃孵育混合(稀釋法)。但由于與特異性CTLs表面TCR結合的MHC-肽復合物容易迅速解離，以致難以得到較為真實的結果。后來Altman等改進了制備工藝，將四個MHC-肽復合物連成一個四聚體，從而可獲得理想穩定的結果。

常規的四聚體制備過程如下：首先，選擇檢測某一特定的抗原特異的T細胞所識別的抗原表位和與該表位結合MHC分子的類型；通過設計特異的引物擴增所選MHC分子的胞外區，并在其COOH端加上15個特異的氨基酸(BirA酶可識別該序列，并將該序列中的賴氨酸進行生物素標記)；表達MHC分子融合蛋白，將其與β2m和多肽進行體外折疊，形成MHC-β2m-肽復合物，并純化該復合物；MHC-β2m-肽復合物在BirA酶的作用下，被生物素標記；生物素標記的MHC-β2m-肽復合體與熒光標記(PE或FITC)的親和素以4∶1的比例相混合，即得到熒光標記的四聚體。

構建MHC/肽四聚體之前需要獲得大量的MHC/肽單體復合物，而MHC/肽單體復合物的生成需要大量原核表達的MHC重鏈和β2微球蛋白，然后在高濃度的體外合成多肽的存在下重折疊而成。

MHC分子的結構與功能是近年來的免疫學界研究熱點之一。MHC?I遞呈被CTL識別的抗原肽，在誘導機體產生抑制病毒增殖、控制腫瘤生長的細胞免疫反應過程中起關鍵作用。如何準確評價細胞免疫特別是特異性CTL反應一直是困擾免疫學家們的難題。1996年Altman等(Altman?et?al.，1996，Science?274：94)建立了MHC四聚體技術，他將MHC?I類分子、抗原肽和熒光染料標記聯接蛋白組成的單體物通過親和素鉸鏈成為四聚體復合物來定量檢測HIV特異性CTL，獲得了理想的結果。

β2m是組成MHC?I類分子復合體的輕鏈分子，對于MHC?I類分子在細胞表面穩定表達和有效遞呈抗原肽必不可少，并且β2m能促進抗原肽與細胞表面MHC?I類分子的結合；它也是制備MHC?I類分子四聚體的必要成分之一。