[發明專利]雞主要組織相容性復合體/肽四聚體的構建方法及其產品

有效

• 申請號: 200710152068.1
• 申請日: 2007-09-28
• 公開（公告）號: CN101397562A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 吳東來;劉光亮;王群;肖一紅;童鐵鋼;白宇;張維軍;徐樹蘭;張文龍;殷喆
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N1/21;C07K19/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨

1.一種雞主要組織相容性復合體/肽四聚體的構建方法，包括：

(1)按照現有技術分別分離、克隆雞BF2全基因和雞Chβ2m全基因；

(2)以雞BF2全基因為模板，以SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2為引物按照常規PCR擴增方法，擴增得到去除了BF2的胞內區和跨膜區序列，并在C-末端融合了一段生物素化序列的雞BF2基因片段；將該雞BF2基因片段與pET-28a(+)表達載體相連接得到重組表達載體pET-BF2-BSP；將重組表達載體pET-BF2-BSP轉化大腸桿菌，誘導目的基因表達，收集、純化所表達的重組融合蛋白，得重組雞BF2蛋白；

(3)以雞Chβ2m全基因為模板，以SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4為引物按照常規PCR擴增方法，擴增得到去除了信號肽序列的雞Chβ2m基因片段；將所擴增得到雞Chβ2m基因片段與pET-28a(+)表達載體相連接得到重組表達載體pET-Chβ2m；將重組表達載體pET-Chβ2m轉化大腸桿菌，誘導目的基因表達，收集、純化所表達的重組蛋白，得重組Chβ2m雞蛋白；所述誘導目的基因表達的條件如下：IPTG的濃度是0.3mmol/L?IPTG，菌體濃度OD_600nm在0.6，誘導時間為5h；

(4)按照現有技術方法制備得到MHC限制性多肽IBV?N_71-78；將步驟(2)和步驟(3)所制備的重組雞BF2蛋白和重組Chβ2m雞蛋白分別稀釋后加入到溶解有MHC限制性多肽IBV?N_71-78的重折疊緩沖液中，孵育8-44小時，濃縮，純化，得到雞BF2/肽單體復合物；

(5)將雞BF2/肽單體復合物生物素化，純化，將PE-鏈霉親和素分批次的加入到生物素化后的雞BF2/肽單體復合物中，所加入的PE-鏈霉親和素的總體積與雞BF2/肽單體復合物的比例為1∶5；孵育，純化濃縮，即得雞主要組織相容性復合體/肽四聚體。

2.按照權利要求1的構建方法，其特征在于：步驟(2)中所述誘導目的基因表達的條件如下：IPTG的濃度是1.1mmol/L，菌體濃度OD_600nm在0.8-1.2，誘導時間為2-4h。

3.按照權利要求1的構建方法，其特征在于：步驟(2)或(3)中純化所表達的融合蛋白的方法如下：將大量表達的菌體經超聲波裂解且洗滌后分別獲得BF2-BSP包涵體和Chβ2m包涵體，將BF2-BSP包涵體和Chβ2m包涵體用濃度為8mol/L的脲溶解后與Ni²⁺NTA樹脂結合，加入色譜柱空純化柱，混勻，棄去上清，用結合緩沖液預洗1次，再用洗滌緩沖液洗滌2次，最后用洗脫液洗脫2次，收集用洗脫液洗脫得到的2次洗脫液，得到純化的重組融合蛋白。

4.按照權利要求1的構建方法，其特征在于：步驟(4)中所述的濃縮采用超濾濃縮設備進行濃縮，該超濾濃縮設備采用氮氣提供壓力。

5.按照權利要求1的構建方法，其特征在于：步驟(5)中所述的純化采用用凝膠過濾柱的方式純化。

6.按照權利要求1的構建方法，其特征在于：步驟(5)中所述的純化濃縮采用100kD的蛋白濃縮超濾離心管進行純化濃縮。