[發明專利]一種磷脂酶D的生產方法

無效

• 申請號: 200710135354.7
• 申請日: 2007-11-07
• 公開（公告）號: CN101182498A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 張梁;吳斌
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種磷脂酶D的生產方法，涉及發酵領域。具體的說是采用固態發酵的方法生產磷脂酶D，以小麥、麩皮、豆餅粉和麥糟為固態基質，并添加磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、葡萄糖等物質，通過固態發酵生產磷脂酶D。

背景技術

磷脂作為一種生物活性物質，有著獨特的理化性質和營養價值，在世界范圍內的食品、保健品、醫藥以及飼料行業已被廣泛使用。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是磷脂家族中的一員，近20年來國內外的動物試驗及臨床應用，表明PS對改善記憶和認知能力、防治老年癡呆癥、抑郁癥及緩解精神壓力都有顯著療效。

目前大規模生產磷脂酰絲氨酸的重要性不僅僅在于其生物學及工業化應用潛力，同時也與其在保健、營養品方面的逐漸應用有關。然而無論從自然界分離提取或化學合成法生產磷脂酰絲氨酸都十分復雜，目前研究人員正尋求利用酶特別是磷脂酶D進行酶法轉化來定向合成磷脂酰絲氨酸，如專利申請文獻1～3。[專利申請文獻1：公開號CN155288A；專利申請文獻2：公開號CN1897919A；專利申請文獻3：公開號CN1468314A]

磷脂酶D(Phospholipase?D，PLD；EC?3111414)首先發現于植物中(如卷心菜、花生等作物)，之后在微生物(鏈霉菌、大腸桿菌、沙門氏菌等)和哺乳動物細胞中均有發現。它不但可以水解卵磷脂生成磷酸脂和膽堿，通過打斷其磷酸酯鍵完成反應，而且當有分子作為親核供體時，磷脂酶D能催化轉酯反應。同時，來自微生物界的磷脂酶D相對于來自植物界的有更強大的轉酯能力，底物特異性低。其中又以源自鏈霉菌屬的磷脂酶D的轉酯能力尤為突出。

但是，目前采用液體發酵產酶水平低、發酵周期長(一般要接近7天)、生產成本高等缺點給實際應用帶來了很多困難。

發明內容

本發明的目的是提供一種磷脂酶D的生產方法，用固態發酵，具有單位基質酶活高，發酵周期短，生產成本低等特點，為大規模應用提供了便利條件。

本發明的技術方案：一種磷脂酶D的生產方法，以小麥、麩皮、豆餅粉和麥糟為固態基質，并添加磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和葡萄糖，通過固態發酵生產磷脂酶D；

以肉桂鏈輪絲菌AS?4.1084為出發菌株；該菌株詳見中國科學院典型培養物保藏委員會菌種目錄網頁http://www.ctcccas.ac.cn/，本申請人亦可向公眾提供。

固態基質：以麥糟為基本質量單位，小麥、麩皮、豆餅粉添加比例為：小麥添加麥糟質量的2％～5％，麩皮添加麥糟質量的5％～10％，豆餅粉添加麥糟質量的3％～8％；固態基質按常規加水進行蒸煮備用；

磷酸二氫鉀的添加量為固態基質和水總質量的0.1％～0.4％，七水硫酸鎂的添加量為固態基質和水總質量的0.03％～0.075％，葡萄糖的添加量為固態基質和水總質量的0.4％～1％；

固態發酵條件：接種量為：菌株的種子培養液與固態培養基總質量的體積質量比為5％～10％，發酵初始水份為56％～68％；發酵初始pH?6.8～7.2，發酵過程品溫25～32℃，發酵時間72～120小時。

所述的磷脂酶D的生產方法，麥糟改用麥糟、玉米芯、干玉米秸稈中的任意一種或幾種的組合物替代。

所述的磷脂酶D的生產方法，麥糟、玉米芯、干玉米秸稈需粉碎，粉碎的細度為1～3cm。

本發明所述的肉桂鏈輪絲菌AS?4.1084購自中國科學院典型培養物保藏委員會。

本發明所述方法中其它沒有具體描述的部分均采用本技術領域公知的或已公開報道的方法。在本發明所進行的描述中，如無特別說明均為質量百分比。

本發明的有益效果：1)固態發酵是一種傳統的發酵方法，由于固態發酵水分少，每克基質的體積小，這將帶來一系列的好處：如a、要處理的廢水量很少；b、產品濃縮在基質里，往往不要過濾濃縮就可以使用；c、即使要萃取制成酶制劑，所需的溶劑量較少；d、成品儲藏所需的場地較少；

2)同液體發酵相比具有單位基質酶活水平高，發酵周期短，生產成本低等特點，為實際大規模應用提供了便利條件。

具體實施方案

實施例1磷脂酶D酶活測定

步驟一：隨機均勻的取10g固體發酵物，加入50mL純凈水，振蕩搖勻，在20℃條件下浸泡1h，離心分離得到含磷脂酶D的浸出液。同時，另外再隨機均勻的取10g固體發酵物，測定其中的絕干物質含量。